ADHP(Amplex Red)

보관:

수령 후 ADHP 프로브와 HRP를 분주해서 -20ºC에 보관합니다. 여러 번의 동결/융해 사이클을 피하도록 합니다. 키트의 나머지 구성 요소는 4ºC에 보관합니다. ADHP는 광에 민감하므로 이에 따라 보관하시기 바랍니다.

시약 준비 주의:

모든 시약은 사용 전에 실온으로 되돌려야 합니다.

• 1X 분석 버퍼 : 50 mM Tris–HCl 버퍼 pH7.4

• ADHP 원액： 10 mM 용액의 DMSO.

• HRP 원액:  100 U/mL 글리세롤 용액.

• H2O2 원액:   8.8 M 용액

*주의: 하나의 단위는 pH 6.0 및 20ºC 조건에서 20초 동안 피로갈롤로부터 1.0 mg 퍼퓨로갈린을 형성하는 효소의 양으로 정의됩니다.

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• ADHP/HRP 작업 용액 (과산화수소 분석): 과산화수소를 측정하는 경우에 ADHP를 최종 농도 100 µM으로 HRP를 최종 농도 0.2 U/mL로 1X 분석 버퍼에 첨가해서 ADHP/HRP 작업 용액을 준비합니다 (예: 50 µL ADHP 원액과 10 µL HRP 원액을 4.940 mL 1X 분석 완충액에 첨가). 이 부피는 약 100회 분석에 충분합니다. ADHP/HRP 작업 용액은 1일간 안정합니다. 즉시 사용할 양만 준비하시기 바랍니다.

• ADHP/H₂O₂ 작업 용액 (퍼옥시다제 분석): 퍼옥시다제를 측정하는 경우에 ADHP를 최종 농도 100 µM으로 H₂O₂를 최종 농도 2 mM으로 1X 분석 버퍼에 첨가해서 ADHP/H₂O₂ 작업용액을 준비합니다. 먼저 H₂O₂ 원액을 1X 분석 버퍼에서 1:1000으로 희석합니다. 즉시 적용에 필요한 양만 사용합니다 (예: 5 μL H₂O₂를 4.995 mL 1X 분석 버퍼에 첨가). 이 용액의 농도는 8.8 mM입니다. 이 8.8 mM H₂O₂ 용액을 사용해서 ADHP/1X 분석 버퍼에서 2 mM H₂O₂ 용액을 준비합니다 (예: 50 µL ADHP 원액과 제조된 8.8 mM H₂O₂ 용액 1.14 mL을 3.81 mL 1X 분석 버퍼에 첨가). 이 부피는 약 100회 분석에 충분합니다. 작업 용액은 1일간 안정합니다. 즉시 사용할 양만 준비하시기 바랍니다.

시료 준비 

• 세포 배양 상청액: 불용성 입자를 제거하기 위해 10,000 rpm으로 5분간 원심분리합니다. 상청액은 직접 분석하거나 필요에 따라 희석할 수 있습니다. 동일한 비조건 배지에서 H₂O₂ 표준 곡선을 준비합니다. 분석을 방해하므로 혈청은 피하도록 합니다. 참고: ADHP가 높은 pH(>8.5)에서 불안정하므로 최적의 작업 조건을 위해 pH를 7에서 8 사이로 유지합니다.

•세포 용해액: 세포를 PBS 또는 1X 분석 버퍼에서 1-2 x 10⁶ 세포/mL로 소생시킵니다. 얼음 위에서 세포를 균질화하거나 초음파 처리합니다. 잔해를 제거하기 위해 원심분리합니다. 세포 용해액은 희석하지 않고 분석하거나 필요에 따라 적정할 수 있습니다.

• 혈장, 혈청 또는 소변: 불용성 입자를 제거하기 위해 10,000 rpm으로 5분간 원심분리합니다. 상청액은 직접 분석하거나 필요에 따라 희석할 수 있습니다. 희석하지 않은 혈청 또는 혈장은 분석을 방해할 수 있습니다.

노트:

• 모든 시료는 즉시 분석하거나 -80°C에 최대 1-2개월간 보관해야 합니다. 필요에 따라 적절한 대조군을 실행합니다. 시료의 최적 실험 조건은 연구자가 결정하도록 합니다. 항상 시료와 함께 표준 곡선을 실행합니다.

• 총 H₂O₂ 또는 퍼옥시다제 양에 따라 연속 희석이 필요합니다. 극도로 높은 수준의 H₂O₂ (≥ 500 µM 최종 농도) 또는 퍼옥시다제 (≥ 100 mU/mL)는 과량의 H₂O₂ 또는 퍼옥시다제가 반응 생성물인 레조루핀을 비형광성 생성물인 레사주린으로 추가 산화시킬 수 있으므로 형광을 감소시킬 수 있습니다.

• NADH 농도가 10 μM 이상이고 글루타티온 농도가 50 μM 이상인 시료는 ADHP 프로브를 산화시켜 잘못된 판독값을 초래할 수 있습니다. 이러한 간섭을 최소화하기 위해 반응에 최종 농도 40 U/mL의 슈퍼옥사이드 디스무타아제(SOD)를 첨가하는 것이 권장됩니다.

• 레조루핀이 티올 존재 하(10 μM 이상)에서 불안정하므로 DTT 또는 β-메르캅토에탄올을 함유한 시료는 피하도록 합니다.

표준 곡선 준비 

• H₂O₂ 표준: H₂O₂ 표준을 준비하기 위해 먼저 H₂O₂ 원액을 1X 분석 버퍼에서 1:1000으로 희석합니다. 즉시 사용할 양만 준비합니다 (예: 5 μL H₂O₂를 4.995 mL 1X 분석 버퍼에 첨가). 이 용액의 농도는 8.8 mM입니다. 이 8.8 mM H₂O₂ 용액을 사용하고 1X 분석 버퍼에서 추가 희석해서 0 µM – 100 µM 농도 범위의 표준을 준비합니다 (예: 11.5 µL H₂O₂를 988.5 µL 1X 분석 버퍼에 첨가 - 아래 표 1 참조). H₂O₂ 희석 용액과 표준은 신선하게 준비하시기 바랍니다.

• 퍼옥시다제 표준: 퍼옥시다제 표준을 준비하기 위해 먼저 HRP 원액을 1X 분석 버퍼에서 1:1000으로 희석합니다 (예: 5 μL HRP 원액을 4.995 mL 1X 분석 버퍼에 첨가). 즉시 사용할 양만 준비합니다. 이 용액의 농도는 100 mU/mL입니다. 이 100 mU/mL 용액을 사용하고 1X 분석 버퍼에서 추가 희석해서 0 mU/mL – 10 mU/mL 농도 범위의 표준을 준비합니다 (아래 표 2 참조). HRP 희석 용액과 표준은 신선하게 준비해야 합니다.

분석 프로토콜

I. 과산화수소

1.사용 전 모든 시약을 철저히 준비하고 혼합합니다. 미지 시료와 표준을 포함한 각 시료는 이중 또는 삼중으로 분석해야 합니다.

2.각 시료(H₂O₂ 표준, 대조 그룹 또는 미지) 50 µL을 개별 마이크로 오리판

에 첨가합니다.

3.각 웰에 ADHP/HRP 작업용액 50 µL을 첨가한다. 웰 내용물을 철저히 혼합하고 실온에서 광으로부터 보호해서 30분간 배양합니다. 참고: 이 분석은 연속적(종료되지 않음)이므로 반응 동역학을 추적하기 위해 여러 시간점에서 측정할 수 있습니다.

4. 530-570 nm 범위의 흥분과 590-600 nm 범위의 발광이 가능한 형광 효소 표지로 판을 판독합니다.

5. 시료 RFU를 표준 곡선과 비교해서 시료 내 과산화물 농도를 계산합니다. 영 H₂O₂ 대조 그룹 값에서 해당 값을 뺍니다.

II. 퍼옥시다제

1.사용 전 모든 시약을 철저히 준비하고 혼합합니다. 미지 시료와 표준을 포함한 각 시료는 이중 또는 삼중으로 분석해야 합니다.

2.각 시료(HRP 표준, 대조군 또는 미지) 50 µL을 개별 미세기공판에 첨가한다.

3.각 웰에 ADHP/H₂O₂ 작업 용액 50 µL을 첨가합니다. 웰 내용물을 철저하게 혼합하고 실온에서 광으로부터 보호해서 30분간 배양합니다. 참고: 이 분석은 연속적(종료되지 않음)이므로 반응 동역학을 추적하기 위해 여러 시간점에서 측정할 수 있습니다.

4. 530-570 nm 범위의 흥분과 590-600 nm 범위의 발광이 가능한 형광 효소 표지로 판을 판독합니다.

5. 시료 RFU를 표준 곡선과 비교해서 시료 내 퍼옥시다제 농도를 계산합니다. 영 HRP 대조 그룹 값에서 해당 값을 뺍니다.

이 프로토콜은 지침만 제공하고 특정 필요에 따라 수정되어야 합니다.