Alexa Fluor 647 NHS ester TEA는 활성화된 카르복실기(NHS 에스터)를 포함해서 일차 아민(R-NH₂)이 있는 기질(예: 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 핵산)과 공유 결합을 통해 형광 표지가 가능한 널리 사용되는 형광 염료이다. 최대 여기 파장은 650 nm, 최대 방출 파장은 665 nm이다. N-hydroxysuccinimide (NHS) 에스터는 N-말단 시스테인을 포함한 단백질과 친핵 치환 반응을 일으켜 새로운 아미드 결합을 형성해서 단백질 표지를 가능하게 한다 [3]. Alexa Fluor 647 NHS ester TEA는 직접확률 광학재건현미경(dSTORM) 조건에서도 우수한 성능을 보고 세포 생체 이미징 및 초해상도 현미경 분야에 일반적으로 응용된다 [4].현미경 촬영 조건에서 Alexa Fluor 647 NHS ester TEA는 가역성 광선 유도 이성질화를 통해 두 가지 암흑 상태를 형성하고 dSTORM의 블링킹 현상과 관련이 있다. 초해상도 형광 현미경에서는 이러한 광유도 “깜박임”을 이용해서 형광단의 위치를 정밀하게 파악해서 광학 회절 한계를 뛰어넘는 공간 분해능을 얻을 수 있다. Alexa Fluor 647 NHS ester TEA의 영구 광표백 양자수율은 매우 낮고 혐기성 산화환원 버퍼를 사용해 추가로 억제할 수 있다[5]. 게다가phalloidin등의 표지 시약과 함께 세포 라인 염색이나 거대한 단층 소포체(GUVs)의 염색에도 활용될 수 있다[6-7].
References:
[1] Anderson GP, Nerurkar NL. Improved fluoroimmunoassays using the dye Alexa Fluor 647 with the RAPTOR, a fiber optic biosensor. J Immunol Methods. 2002;271(1-2):17-24.
[2] Wuethrich I, Guillen E, Ploegh HL. A mouse monoclonal antibody against Alexa Fluor 647. Monoclon Antib Immunodiagn Immunother. 2014;33(2):109-120.
[3] Jiang H, D'Agostino GD, Cole PA, Dempsey DR. Selective protein N-terminal labeling with N-hydroxysuccinimide esters. Methods Enzymol. 2020;639:333-353.
[4] Fan S, Webb JEA, Yang Y, et al. Observing the Reversible Single Molecule Electrochemistry of Alexa Fluor 647 Dyes by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 2019;58(41):14495-14498.
[5] Karlsson JKG, Laude A, Hall MJ, Harriman A. Photo-isomerization of the Cyanine Dye Alexa-Fluor 647 (AF-647) in the Context of dSTORM Super-Resolution Microscopy. Chemistry. 2019;25(65):14983-14998.
[6] Moghal MMR, Islam MZ, Sharmin S, Levadnyy V, Moniruzzaman M, Yamazaki M. Continuous detection of entry of cell-penetrating peptide transportan 10 into single vesicles. Chem Phys Lipids. 2018;212:120-129.
[7] Bharadwaj A, Kumar A, Mitra R, Jaganathan BG, Boruah BR. Enhanced fluorescence blinking of AF647 fluorophores in Mowiol via violet and UV light induced recovery for superior localization microscopy. Methods Appl Fluoresc. 2024;12(3):10.1088/2050-6120/ad4ae6.