Collagenase IV

Collagenase IV를 사용하여 흐름 사이토메트리 분석을 위한 단일 세포 분리 프로토콜[1]:

1.자궁 내막 표본은 1mm³의 조각으로 쪼개져 37℃에서 1mg/mL의 Collagenase IV, 0.2mg/mL의 DNase, 1mg/mL의 소축우유단백질 DPBS로 30분 동안 분해됩니다. 2.세포Suspension은 메쉬를 통과시켜 PBS로 씻어, ACK 버퍼(0.01 M KHCO3 버퍼 0.16 M, NH4Cl, 0.1 mM 에틸렌다이아밍 테트라에이트산 [EDTA])로 처리하여 적혈구를 제거하고 씻어 PBS에서 재수정됩니다.

3.분리된 세포는 인체 면역글로불린으로 10분간 배양되어 다양한 면역 세포군의 특정 항원에 대한 형광항체로 염색됩니다.

4.4℃에서 30분간 배양한 후 세포는 씻어 fluorescence -activated cell sorter (FACS) 버퍼에서 재수정되어 FACS 정류 흐름 사이토메트리에서 분석됩니다. 표지되지 않은 세포와 동형항체가 대조구로 사용됩니다.

이 프로토콜은 가이드라인을 제공할 뿐이며 사용자의 구체적인 필요에 따라 수정되어야 합니다.

Collagenase IV 순환법을 사용하여 원천 쥐간세포를 분리하고 추출하는 프로토콜[2]:

2단계 순환법

(1) 준비: 유액과 고당 DMEM 배양액을 42℃ 물욕에서 30분 전열하여 동물 실험 테이블과 수술 기기를 준비하고 세척된 운영 테이블을 30분간 자외선으로 조사합니다. 펌프 튜브는 콜라게나제 유액 1을 순환하여 공기를 방지합니다.

(2) 용액 준비: 콜라게나제 유액 1: EDTA 0.5 mmol /L, D-Hanks 용액 10 mL; Collagenase 유액 2: 프로틴아제 E3 2mg, Hanks 용액 8mL; Collagenase 유액 용액 3: Collagenase IV 4.8 mg, Hanks 용액 12.5 mL; 세정 용액: DNase I 0.02 mg/mL, Grignard 밸런스 소금 용액 50 mL; 정제 용액: 50% 실리케이트드 폴리비닐피롤리도늄 (PVP) 밀도 경도 중심층분 샘; 완성 매체: 인슐린 0.5μg/mL, dexamethasone 100nmol/L, 잔스트레톰시스민 1%, 태태 소축 10%, 고당 DMEM 배양액 200mL.

(3) 유액 투여: 쥐는 CO2 뇌혈로 죽이고 알코올에 10~20초 동안 담갔습니다. 멸균 조작 테이블로 옮깁니다. 쥐를 해부하여 복강과 전체 흉강을 노출시키고 있습니다. 하대정맥의 위 간 분절을 결졍하고 하대정맥에서 수평으로 에 들어 갑니다. 유속을 시작하고 간문맥을 작게 절개하세요. 유속 속도는 3 mL/분으로; collagenase 유액 1을 9 mL 사용하고 유출액이 맑아지면 주입이 중지됩니다. 펌프 튜브를 collagenase 유액 2로 바꾸어 유속을 계속하고 약 8 (또는 15) mL의 collagenase 유액 2를 사용하십시오. 간이 점점 부풀면서 유리 바늘로 간을 살짝 누르면 구부러지고 느리게 반등하면 됩니다. collagenase 유액 3으로 바꾸어 11 mL (또는 21 mL)을 사용합니다. 더 많은 세포가 필요하면 유속량과 시간을 증가시킬 수 있습니다.

(4) 분리: 각 간엽을 연결하는 섬유다발들의 모임을 집어서 연결조직을 따라 잘라 collagenase 유액 용액 3이 들어있는 센트리퓨징관에 넣고 닫아 42℃에서 5분 동안 전열합니다. 간을 10% 태태 소축액 매디엄에 담긴 페트리 디시에 담가 간을 찢는 작업을 하고 (간섹트 포막을 살짝 벗겨내고 핀서로 섬유묶음을 잡아서 흔들어 나머지 세포를 분산시킴), 200-그물 필터를 통해 걸러내면 걸러진 액체가 간세포 정지였습니다.

(5) 정화: 여과된 간세포 서지는 50mL 원심분리기 튜브로 이송하여 저온과 속도로 원심분리를 진행합니다 (4℃, 50×g, 3분). 상청을 버리고 15 mL 세정 용액을 추가하여 살짝 3번 원심분리를 반복합니다. 상청을 버리고 10 mL 완성 매체를 추가하여 세포를 재수정하고 천천히 10 mL 정제 용액을 추가하여 원심분리를 진행합니다 (4℃, 400×g, 10분), 상층을 버리고 남은 세포 침전물이 간실질세포입니다, 5 mL 완성 매체를 추가하여 세포를 재수정합니다.

이 프로토콜은 지침을 제공할 뿐이고 당신의 구체적인 필요에 따라 수정되어야 합니다.

참조 문헌:

[1]. Gnainsky Y, Granot I, et,al. Local injury of the endometrium induces an inflammatory response that promotes successful implantation. Fertil Steril. 2010 Nov;94(6):2030-6. doi: 10.1016/j.fertnstert.2010.02.022. Epub 2010 Mar 24. PMID: 20338560; PMCID: PMC3025806.

[2].Ren Wenjie, Lin Zhexuan. Trypsin and collagenase perfusion method of separation of the original generation of liver cells in mice to compare [J]. Journal of shantou university medical college, 2022, 35 (4) : 204-209. The DOI: 10.13401 / j.carol carroll nki jsumc. 2022.04.003.