DC-Chol (hydrochloride)

DC-Chol을 이용한 포유류 세포 형질전환 실험적 방법^[1]

본 프로토콜은 참고용으로만 사용하고 실제 필요에 따라 조정하시기 바랍니다.

(1) 양이온성 리포솜 제조: 1.2μmol DC-Chol과 0.8μmol DOPE를 클로로포름에 용해하였습니다. 대조 용매를 증발시킨 후 잔여물을 진공 하에서 건조하였습니다. 필름을 1mL 무균 20mM HEPES 완충액(pH=7.8)으로 4°C에서 24시간 수화하였습니다. 소생된 용액을 수조에서 5-10분 초음파 처리해서 평균 직경 150-200nm의 리포솜을 형성하였습니다.

(2) 세포 배양 및 접종 (A549 세포를 예로 들음): A549 세포는 10% 태아 소 혈청이 포함된 F12 배양지에서 배양되었습니다. 형질전환 하루 전에 세포를 35mm 배양 접시에 접종해서 약 80% 융합까지 성장시켰습니다.

(3) 형질전환 절차: 형질전환 1-10분 전에 양이온성 리포솜을 12×75mm 폴리스티렌 튜브 바닥에 배치하였습니다. 1mL 무혈청 배양지로 희석된 플라스미드 DNA (4μg/mL)를 첨가해서 혼합하였습니다. 이 후에 혼합물을 무혈청 배지로 한 번 세척한 세포에 첨가하였습니다. 세포를 37°C에서 5시간 배양한 후 배양지를 혈청 포함 배지로 교체하였습니다. 형질전환 후 36시간에 세포를 회수하였습니다.

주의 사항:

(1) DC-Chol은 카바메이트 결합을 포함합니다. 리포솜 형질전환 활성은 4°C에서 6주 저장 후에도 감소하지 않는다.

(2) 과량의 DNA(>4μg/mL)는 양이온 전하를 포화시켜 형질전환 효율을 감소시킵니다. DNA 농도가 너무 낮을 때 과량의 양이온성 리포솜은 경미한 세포 독성을 유발할 수 있습니다.