Fluo-4 AM

이 프로그램은 가이드만 제공하고 구체적인 필요에 따라 수정하시기 바랍니다.

1.염색 용액 준비

(1) 보관 용액 구성: 무수 DMSO에서 농도가 1-10mm인 AM 에스터 보관 용액을 준비하사기 바랍니다.

비고:

② 사용하지 않은 보관 용액은 반복되는 냉동과 해동을 피하기 위해 -20°C나 -80°C에서 빛을 피해 보관합니다;

② Fluo-4AM은 쉽게 수분을 흡수하므로 사용하기 전에 건조한 환경에서 실온으로 놓아두고 엽니를 열기 전에 잠시 원심 분리하여 튜브 바닥에 가루가 떨어지도록 하십시오.

(2) 작업 용액 구성: 적절한 버퍼(예: 무쳘청은 과 붉 페놀 매체나 PBS)로 보관 용액을 희석하고 농도가 1-10μM인 작업 용액을 준비하십시오.

비고:

(1)Fluo-4 AM 염색 용액을 준비할 때 보관 용액에 적당량의 20% Pluronic F-127 용액을 추가하여 AM 프로브의 수 용해성을 향상시켜야 합니다;

②Pluronic F-127은 Fluo-4 AM이 용액에서 쌓이는 것을 방지하고초 더 나은 프로브 세포 내 침투를 촉진할 수 있습니다. 그러나 Pluronic F-127은 AM 프로브의 안정성을 낮출 수 있으므로 작업 용액 준비 시에만 Pluronic F-127을 추가하고 장기 보관용 보관 용액에 추가하지 않기를 추천합니다.

③ 20%(w/v) Pluronic F-127 모음액 준비: Pluronic F-127 분말 100mg(품목 번호: GB30090)을 가볍게 측량하여 500μL DMSO를 추가하고 40-50℃에서 20-30분간 가열한 후 실온에서 보관하십시오. 결정물이 생기면 다시 가열하여 녹여 사용할 수 있고 사용에 영향을 미치지 않습니다;

④ (선택사항) GLPBIO에서 녹여져 있는 Pluronic F-127(20% Solution in DMSO)을 제공합니다, 제품 번호: GB30091; 보관 용액에 20% Pluronic F-127 용액을 동일한량을 추가하여 최종 작업 농도의 Pluronic F-127이 약 0.02%가 되도록 하십시오;

실제 상황에 따라 작업 용액의 농도를 조정하고 반복되는 냉동과 해동을 피하기 위해 즉시 사용하십시오.

2.세포 소생 염색

(1)소생된 세포: 4°C, 1000g에서 3-5분간 원심 분리하여 상층액을 버리고 PBS나 기타 버퍼로 두 번 매번 5분간 세착합니다;

(2) 부착 세포: PBS나 기타 버퍼로 두 번 씻은 후 췌장 효소로 세포를 분해하고 분해 후 1000g으로 3-5분간 원심 분리합니다;

(3) 세포를 염색 작업 용액으로 다시 소생시키고 상온 이하에서 어두운 곳에서 20분에서 2시간 동안 배양합니다. 서로 다른 세포의 최적 배양 시간은 다르고 구체적인 실험 요구에 따라 스스로 탐색합니다;

비고:

① 대부분의 세포에서 AM 에스터 염료의 권장 작업 농도는 4-5μM이고 구체적인 농도는 실험 요구에 따라 최적화되어야 합니다. 과다 부하로 인한 세포 독성을 피하기 위해 가능한 효과적인 결과를 얻는 데 기반하여 가장 낮은 염료 농도를 사용하는 것이 좋습니다.

② (선택사항) 세포에 유기 음이온 수송체가 포함되어 있다면 프로설파솔(GC16825, Probenecid, 1-2.5mM)이나 설피론(GC11049, Sulfinpyrazone, 0.1-0.25mM)를 세포 매체에 추가하여 탈에스테르화 염료의 유출 수준을 줄이려고 할 수 있습니다. 보관 용액은 알칼리성이므로 매체를 추가한 후 pH를 재조정해야 합니다;

③ 만약 세럼이 포함된 매체를 사용하면 혈청 락타아제가 AM을 분해하여 염료로딩 효과를 낮추게 됩니다; 페놀 레드를 포함한 배양 매체는 배경값을 살짝 높이게 만들 수 있으므로 염료 용액을 추가하기 전에 표지 없는 배양 매체로 세포를 2∼3회 세척하는 것이 추천됩니다.

④ 염료의 로딩 온도를 낮추면 염료의 현지화를 줄일 수 있습니다.

(4) 배양 후 1000g으로 5분간 촤속하여 염료 용액을 제거하고 PBS나 기타 버퍼를 추가하여 2-3회 세착고 남아 있는 염료를 제거합니다;

(5) 상온에서 30분간 배양하여 세포 내 AM의 완전한 탈에스테르화를 보장합니다.

3. 고착 세포 염색

(1) 고착 세포를 소독된 커버 글라스에 배양합니다;

(2) 매체에서 커버 글라스를 제거하고 과도한 매체를 흡인하여 커버 글라스를 습한 환경에 놓습니다;

(3) 커버 글라스의 한 모퉁이에 100μL의 염료 작업 용액을 추가하고 염료를 살짝 흔들어 모든 세포를 고르게 덮도록 합니다;

(4) 상온 이하에서 어두운 곳에서 20분에서 2시간 동안 배양합니다. 서로 다른 세포의 최적 배양 시간은 다르고 구체적인 실험 요구에 따라 스스로 찾아보아야 합니다;

(5) 배양 종료 후 염료 작업 용액을 흡수하여 버리고 PBS나 기타 버퍼 용액으로 커버 글라스를 2∼3회 세착합니다;

(6) 상온에서 30분간 배양합니다.

4. 현미경 탐지: Fluo-4AM의 최대 자외선/발산파장은 494/506 nm입니다.

비고:

(1) 작업액을 구성할 때 20% Pluronic F-127 용액을 추가하는 것이 추천되고 Pluronic F-127의 추가는 Fluo-4 AM의 수용액에서의 분산성을 증가시킬 수 있습니다.

(2) 세포 배양액에 프로설파졸(GC16825, Probenecid, 1-2.5mM)이나 설피리돈(GC11049, Sulfinpyrazone, 0.1-0.25mM)를 추가함으로써 Fluo-4 AM의 방출을 줄일 수 있습니다. 보관 용액은 알칼리성이므로 매체를 추가한 후 pH를 재조정해야 합니다.

(3) Fluo-4 AM은 쉽게 수분을 흡수합니다. 냉장고에서 꺼내 사용하기 전에 캡을 열기 전에 건조한 환경에서 실온으로 놓아주세요. 양이 적은 만큼 캡을 열기 전에 잠시 원심분리하여 분말이 튜브 바닥으로 내려가도록 해주세요.

(4) Fluo-4 AM 모음액은 물에 매우 쉽게 분해됩니다. 한 번에 사용하지 못할 경우 예를 들어 5μl/튜브로 포장하여 저장하는 것이 좋습니다. 포장 후 밀봉 필름으로 밀봉 한 얇은 알루미늄 호일로 싸서 밀폐성이 좋은 플라스틱 백에 넣고 실리카겔 건조제 주머니와 함께 묶어 ≤-20°C에서 냉장하고 빛을 피해 보관해 주시기 바랍니다.

(5) 정식 실험 전에 세포 수, 칼슘 이온 형광 프로브의 최종 농도, 배양 시간 등을 탐색하여 적합한 실험 조건을 찾는 것이 좋습니다.

(6) 형광 염료에는 개질문제가 있고 형광 개질을 늦추기 위해 최대한 빛을 피하시기 바랍니다.

(7) 형광 배양 전에 세포를 표지 없는 매체로 세척고 세포 표면에 비특이적인 염료 결합을 제거해야 합니다.