Glu-urea-Lys

이 프로토콜은 참고용입니다. 실제 적용 조건은 귀하의 특정 실험 요구에 따라 최적화할 필요가 있을 수 있습니다.

Glu-우레아-리신 리간드가 결합된 지질 나노입자/siRNA 시스템의 준비[1-2]：

1. 시약 준비: DSPE-PEG2000-NH₂, N-hydroxysuccinimide (NHS), 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), 붕산염 버퍼(0.1M, pH 8.5), 투석 가방(MWCO 3.5kDa), siRNA, 구연산 버퍼(10mM, pH 4.0)

2. Glu-urea-Lys-DSPE-PEG2000 접합물의 제조

2.1 카르복실 활성화: Glu-urea-Lys (1eq), NHS(2eq), EDC(2eq)을 DMF에 녹이고 실온에서 4시간 동안 교반합니다.

2.2 DSPE-PEG2000 접합: 활성화된 생성물을 보레이트 버퍼(pH 8.5)의 DSPE-PEG2000-NH₂(1.2eq)에 방울방울 넣고 실온에서 24시간 동안 빛을 피해서 반응시킵니다.

2.3 정제: 반응 혼합물을 다이알리시스 백에 넣고 밀봉한 후 PBS 버퍼(4°C, 어두운 곳, 48시간)에 담가 소분자 불순물을 제거하고 동결건조 후 접합물을 얻었습니다.

2.4 확인: MALDI-TOF MS를 사용해서 화합물의 분자량을 확인하였습니다(예상 분자량: DSPE-PEG2000 + Glu-urea-Lys ≈ 2800Da + 348Da).

3.지질 나노입자(LNP) 제조와 siRNA의 로딩

3.1 지질 용액의 준비: 각 지질을 DLin-MC3-DMA(50%), 콜레스테롤(38.5%), DSPC(10%), Glu-urea-Lys-DSPE-PEG (1.5%)의 비율에 따라 에탄올에 녹였습니다(총 지질 농도 10mg/mL), 60°C의 수조에서 초음파를 보내 완전히 녹일 때까지 처리하였습니다.

3.2 수상 위상의 준비: siRNA를 시트르산 버퍼(0.2mg/mL)에 녹였습니다.

3.3 미세유체혼합: 지질 위상과 수상 위상을 3:1의 유량비(총 유량 12mL/min)로 혼합하였고 출구는 pH 7.4의 PBS에 모았습니다.

3.4 투석 정화: 반응 혼합물을 투석 봉투에 넣고 밀봉한 후 PBS 버퍼(4°C, 빛을 막음, 48시간)에 담갔고 이 기간 동안 버퍼를 3번 교체했습니다.

4.품질 관리

4.1 입자 크기: DLS 검출(80-100nm, PDI < 0.2).

4.2 봉지 효율: RiboGreen 방법(>95%).

4.3 siRNA의 완전성: agarose gel 전기영동(자유 siRNA 대역이 없습니다).

노트:

1.무균 작업: 체내 실험은 여과 멸균(0.22㎛ 필터 막)이 필요합니다.

2.siRNA 안정성: 제조된 지질 나노입자(LNP)는 반복적인 동결 및 해동을 피하기 위해 -80°C에서 보관해야 합니다.

3.체내 분포: 생체 발광 영상(예: DiR로 표시된 LNP)을 보충하고 표적화를 관찰할 수 있습니다.

References:
[1]. Lee J B, Zhang K, Tam Y Y C, et al. A Glu-urea-Lys ligand-conjugated lipid nanoparticle/siRNA system inhibits androgen receptor expression in vivo[J]. Molecular Therapy Nucleic Acids, 2016, 5.
[2]. Zhou W, Huang J, Xiao Q, et al. Glu-Urea-Lys Scaffold Functionalized Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles Targeting PSMA for In Vivo Molecular MRI of Prostate Cancer[J]. Pharmaceutics, 2022, 14(10): 2051.