m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG

mRNA의 시험관 내 전사 (IVT; 20 μL 반응계)^[1]:

본 프로토콜은 문헌에 기반으로 해서 구체적인 필요에 따라 수정하시기 바랍니다.

버퍼: 40 mM Tris-HCl, pH 7.9; 10 mM MgCl₂; 1 mM DTT; 2 mM 스퍼미딘

템플릿: 50 ng/μL 선형화된 플라스미드

1.버퍼에 10 U/μL T7 RNA 중합효소, 1 U/μL RNase 억제제, 2 mM ATP/CTP/UTP, 0.5 mM GTP 및 3 mM m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG를 첨가해서 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.

참고: m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG를 GTP와 6:1 비율로 첨가한 후 캡핑 효율이 향상됩니다.

2.1 U/μL DNase I를 첨가해서 37°C에서 30분 동안 추가 배양합니다.

3.조 mRNA는 NucleoSpin RNA Clean-up XS를 사용하고 정제하였습니다. 캡이 없는 mRNA는 5'-폴리인산화효소와 Xrn1을 사용해서 제거하였습니다.

4.RP-HPLC를 이용한 dsRNA 불순물 제거: 버퍼 A (0.1 M 트리에틸아민 아세테이트, pH 7.0)에서 버퍼 B (0.1 M 트리에틸아민 아세테이트, pH 7.0, 25% 아세토니트릴 포함)의 선형 구배를 5%에서 50%까지 18분 동안 유속 0.9 mL/min로 적용하였습니다. 수집된 분획으로부터 이소프로판올 침전을 통해 mRNA를 회수하였습니다.