Hippuric acid (2-Benzamidoacetic acid)

세포 라인

제조 방법

4주령 암컷 C57BL/J 쥐로부터 비부착 골수 세포를 분리했습니다. 대퇴골에서 골수 세포를 세척한 후 T175 플라스크에서 2일간 배양하여 기질 세포가 부착되도록 하였습니다. 2일 후에 비부착 세포를 수집해서 적절한 세포 밀도로 적절한 판에 배양하였습니다. 이 세포들은 조혈성 파골세포 전구세포로 간주됩니다. 세포 처리용 조건 혈청은 10% BB 보충 사료 또는 표준 설치류 카세인 사료를 4주간 급여한 암컷 쥐로부터 채취하였습니다. RAW 264.7 세포와 일차 쥐 골수 세포는 10% 태아 소 혈청, 페니실린(100단위/ml), 스트렙토마이신(100µg/ml) 및 글루타민(4mM)이 첨가된 α-최소 필수 배지에서 배양하였습니다.세포를 형태학, RNA 및 단백질 발현 실험을 위해 96웰, 12웰 또는 6웰 세포 배양 판에 공당 적절한 세포 밀도로 접종하였습니다. 85% 융합도에서 96공 판의 세포는 파골세포 형태학 연구를 위해 가용성 RANKL 50ng/ml가 존재하는 조건에서 2.5% 쥐 혈청(7.5% FBS)으로 처리하였습니다. RAW264.7 세포 또는 비부착 골수 세포는 96웰 판(2×10⁴ 세포/공)에서 RANKL 50ng/ml가 있거나 없는 조건에서 배양하였습니다. 세포는 Hippuric acid60µg/dL로 처리하였습니다. RAW264.7 세포 배양 4일 및 골수 세포 배양 5일 후 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 TRAPase 염색 키트를 사용해서 주석산-내성 산성 포스파타제(TRAPase) 활성을 염색하였습니다. 각 공에서 >3개의 핵을 포함하는 TRAP-양성 세포는 에피형광 현미경 하에서 파골세포로 계수하였습니다. 파골세포 흡수 활성 분석을 위해 배양 판의 세포는 Von Kossa 염색을 하거나 하지 않은 채 2.5% 글루타르알데히드를 사용해서 고정하였습니다. 하이드록시아파타이트 흡수 영역은 광학 현미경으로 관찰하고 Image J 소프트웨어를 사용해서 분석하였습니다. 세포 생존율은 MTT 분석법으로 측정하였습니다.

반응 조건

응용 분야

Hippuric acid으로 RAW 264.7 세포와 일차 쥐 골수 세포를 처리하면 파골세포 생성과 파골세포 흡수 활성이 현저하게 억제되었습니다.

동물 모형

제조 방법

7주령 수컷 Sprague Dawley 쥐를 무병원체 환경에서 사육하였습니다. 환경 조건은 습도 50-70%, 온도 22-24℃, 주야 주기 12/12시간이었습니다. 이 쥐들은 표준 실험실 사료를 급여하고 물을 자유롭게 섭취할 수 있었습니다. 1주 적응 기간 후 50마리의 쥐를 대조 수술(신장 노출 수술만) 또는 5/6NX 수술을 받도록 하였습니다. 5/6NX 모델은 전형적인 만성 신장 질환 증상을 모의하고 PUBT 촉진 신장 섬유화를 연구하는 데 일반적으로 사용됩니다.수술 2주 후(실험 1주차) 수술 중 사망한 쥐를 제외하고 대조 수술 그룹 쥐(n=9)는 용매(0.5% DMSO)로 처리하였고 5/6NX 쥐는 두 그룹으로 무작위 배정해서(n=9 each) 다음과 같이 처리하였습니다: (1) 5/6NX 그룹, 0.5% DMSO; (2) 5/6NX + Hippuric acid 그룹, 100mg/kg Hippuric acid. 모든 처리는 복강 내 투여로 10주간 주 5회 시행하였습니다. 쥐 혈청 크레아티닌(SCr)과 혈중 요소 질소(BUN) 함량은 BS-420 자동화 생화학 분석기를 사용해서 평가하였습니다. 신장 시료는 조직학 및 면역조직화학 분석을 위해 고정하였습니다. 세포 내 총 ROS 및 H₂O₂ 농도는 상용 ROS 및 H₂O₂ 분석 법을 사용해서 측정하였습니다.

제형

응용 분야

Hippuric acid은 5/6 신장 절제 만성 신장 질환 랫트 모델에서 혈청 크레아티닌과 혈중 요소 질소 수치를 현저하게 증가시키고 신장 섬유화를 촉진해서 산화환원 항상성을 파괴하였습니다.

References:
[1] Zhao H, Lazarenko OP, Chen JR. Hippuric acid and 3-(3-hydroxyphenyl) propionic acid inhibit murine osteoclastogenesis through RANKL-RANK independent pathway. J Cell Physiol. 2020;235(1):599-610.
[2] Sun B, Wang X, Liu X, et al. Hippuric Acid Promotes Renal Fibrosis by Disrupting Redox Homeostasis via Facilitation of NRF2-KEAP1-CUL3 Interactions in Chronic Kidney Disease. Antioxidants (Basel). 2020;9(9):783.