제품은 연구용으로만 사용됩니다. 인체에 사용할 수 없으며 환자에게 판매하지 않습니다.
| Pack Size | Price | Availability | Quantity | Action |
|---|---|---|---|---|
| 1mg | $184.00 | In Stock | 1 | |
| 5mg | $405.00 | In Stock | 1 | |
| 10mg | $648.00 | In Stock | 1 | |
| 25mg | $1,305.00 | In Stock | 1 |
PFB-FDGlu는 살아있는 세포에서 글루코세레브로시다아제(GCase) 활성을 검출하기 위해 특별하게 사용되는 세포막 투과성 형광 기질이다. PFB-FDGlu는 리소좀 GCase에 의해 절단된 후 녹색 형광 생성물을 방출해서 유세포 측정법, 형광 현미경 또는 고내용량 영상 기술을 통해 개별 세포 효소 활성의 정량적 분석을 가능하게 한다[1].
References:
[1] Labrador-Garrido A, Zhong S, Hughes L, et al. Live cell in situ lysosomal GCase activity correlates to alpha-synuclein levels in human differentiated neurons with LRRK2 and GBA1 mutations. Front Cell Neurosci. 2023 Oct 16;17:1229213.
PFB-FDGlu를 이용한 인간 단핵구 글루코세레브로시다아제 활성 측정 실험 프로토콜
본 프로토콜은 연구 데이터를 개조해서 참조용으로만 제공됩니다. 특정 실험 요구사항에 따라 조정하시기 바랍니다.
(1) 시약 준비: PFB-FDGlu를 디메틸술폰(DMSO)에 용해시켜 37.5mmol/L 원액을 준비합니다(5mg PFB-FDGlu를 154µl DMSO에 용해), 소량 분주해서 -20°C에 보관하고 사용 권장 기간은 1주일입니다; CBE(Conduritol B-epoxide)를 DMSO에 용해시켜 50mM 원액을 준비합니다(5mg CBE를 616.9µl DMSO에 용해), 소량 분주해서 -20°C에 보관합니다; 5% 태아 소 혈청(FBS), 1mM EDTA 및 25mM HEPES를 포함하는 FACS 버퍼를 준비하고 여과 멸균 후 4°C에 보관합니다; RPMI 1640 배지(10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 1% L-글루타민 포함)를 세포 배양 배지로 사용합니다.
(2) 세포 분리 및 준비: 인간 말초 혈액을 BD CPT 항응고제 튜브에 수집하고 실온에서 1800×g로 20분 원심분리해서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 층을 수집합니다. 세포를 DPBS로 1회 세척하고(300×g, 15분) 예열한 배양 배지에 소생시켜 세포 계수를 수행하고 세포 농도를 튜브당 1×10⁶ 세포로 조정해서 세 개의 1.5ml 원심 분리 튜브에 소량 분주합니다(각각 CBE 억제 그룹, DMSO 대조 그룹 및 동형 대조 그룹).
(3) 효소 억제 및 기질 배양: CBE 억제 튜브에 2µl의 50mM CBE 원액(최종 농도 1mM)을 첨가하고 DMSO 대조 그룹에 2µl의 DMSO를 첨가해서 부드럽게 볼텍스 처리한 후37°C, 5% CO₂ 배양기에서 60분 배양합니다. 이후 CBE 억제 튜브와 DMSO 대조 그룹에 각각 2µl의 37.5mM PFB-FDGlu 원액(최종 농도 0.75mM)을 첨가해서 부드럽게 볼텍스 처리하고 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 30분 추가 배양합니다.
(4) 반응 종료 및 표면 마커 염색: 배양 종료 후 즉시 1ml의 차가운 FACS 버퍼를 첨가해서 반응을 종료하고 4°C에서 300×g으로 5분 원심분리하고 상층액을 폐기합니다. 세포를 95µl의 차가운 FACS 버퍼에 소생시키고 5µl의 항인간 CD14-PE-Cy7 항체(CBE 억제 튜브 및 DMSO 대조 그룹용) 또는 동형 대조 항체(동형 대조 튜브용)를 첨가해서 부드럽게 볼텍스 처리한 후 4°C에서 차광해서 20분 배양합니다. 세포 세척을 위해 1ml의 FACS 버퍼를 첨가하고 원심분리해서 상층액을 폐기한 후 세포를 350µl의 FACS 버퍼에 소생시켜 세포 여과망을 통해 유세포 분석 전용 튜브로 여과하고 4°C에서 차광해서 검사까지 보관합니다.
(5) 유세포 측정법 검출 및 데이터 분석: 488nm 레이저와 530nm-FITC 필터(FL1 채널)를 장착한 유세포 측정법을 사용해서 데이터를 획득합니다.
주의 사항:
(1) 본 방법은 신선하게 분리된 PBMC와 해동된 PBMC 모두에 적용 가능합니다(냉동 세포는 해동 후 약 2시간의 회복 배양이 필요함).
(2) 재구성된 PFB-FDGlu의 성능은 보관 시간이 길어짐에 따라 억제됩니다; 사용 권장 기간은 1주일 이내입니다.
(3) 안전과 건강을 위해 작업 시 실험복과 일회용 장갑을 착용하시기 바랍니다.
References:
[1] Hughes LP, Halliday GM, Dzamko N. Flow Cytometry Measurement of Glucocerebrosidase Activity in Human Monocytes. Bio Protoc. 2020 Apr 5;10(7):e3572.
