Calf thymus DNA

Ensayo de actividad de la nucleasa [1]:

1. Preparación de la solución: Calf thymus DNA se disuelve en agua ultrapura estéril (sin DNasa I) para preparar una solución de 1 mg/ml. Durante el proceso de disolución, se puede invertir suavemente a 4 °C para ayudar a la disolución, evitando la vibración ultrasónica y vigorosa. Después de una incubación nocturna a 4 °C, se puede disolver completamente;

Nota: Cuando la concentración es baja (25 μg/mL), el ADN es propenso a adsorberse en la pared interna del tubo de plástico. El ADN se degrada fácilmente en soluciones con un pH superior a 8,0, por lo que no se puede disolver en soluciones alcalinas.

2. Grupo de control negativo: 7,5 μg (7,5 μL de la solución de 1 mg/mL) de Calf thymus DNA se mezcla con 50 μL de Tris; Grupo de control positivo: 7,5 μg (7,5 μL de la solución de 1 mg/mL) de Calf thymus DNA se mezcla con 40 μL de Tris y 10 μL de DNasa I (2U/mL);

3. Todas las muestras se incuban a 37 °C durante 6 horas;

4. Después de la incubación, el ADN completo se precipita con fenol-cloroformo;

5. El ADN se visualiza en un gel de agarosa al 1% que contiene Roti-Gel Stain;

6. La actividad relativa de la nucleasa se determina comparando con las actividades de la nucleasa estándar (0,0,015, 0,03, 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 y 1U/mL de DNasa I).

Este protocolo solo proporciona una guía y debe modificarse de acuerdo con sus necesidades específicas.

References:
[1] Fingerhut L, Ohnesorge B, von Borstel M, et al. Neutrophil Extracellular Traps in the Pathogenesis of Equine Recurrent Uveitis (ERU). Cells. 2019;8(12):1528. Published 2019 Nov 27.