Pronase E (Activity ≥ 7000 U/g)

Gebrauchsanweisung für Pronase E^[1]:

Pronase E ist im pH-Bereich von 5.0-9.0 hochstabil und erreicht die maximale Aktivität bei pH 8.8. Es ist mit vielen Isolationspuffersystemen kompatibel. Pronase E hat eine breite Substratspezifität und kann Proteine in einzelne Aminosäuren spalten. Eine vollständige Inaktivierung wird durch Erhitzen auf 80 ℃ oder höher für 15-20 Minuten erreicht.

Definition der Einheit: Unter Bedingungen von 37 ℃ und pH 7.5 entspricht die Enzymmenge, die eine Farbänderung von 1 µM Tyrosine(181 g Casein) pro Minute bewirkt(gemessen mit der Folin-Phenol-Reagenz-Methode), einer Aktivitätseinheit.

Das Produkt wird breit verwendet. Spezifische Anwendungsmethoden und Arbeitskonzentrationen sollten anhand experimenteller Erfahrung oder der Fachliteratur angepasst werden.

Herstellung der Stammlösung: Lösen Sie das Produkt in deionisiertem Wasser, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 5-20 mg/ml herzustellen. Bei Verwendung in DNA- oder RNA-Isolierungsschritten wird empfohlen, die Lösung 15 Minuten lang auf 56℃ zu erhitzen und dann 1 Stunde lang bei 37℃ zu inkubieren. Die Stammlösung wird in Einzelportionen aufgeteilt und bei -20℃ gelagert; sie ist in der Regel ein Jahr lang haltbar.

DNA-Isolierung: Direkt zum DNA-Präparationssystem(mit 0.5-1% SDS zur Aufhebung von DNA-Protein-Wechselwirkungen)geben. Die typische Arbeitskonzentration liegt bei 250-500 μg Protein/ml, die Inkubation erfolgt 1-4 Stunden bei 37℃.

Proteinverdau: Etwa 0.2 µM Protein in 0.2 ml 50 mM Ammonium-Bicarbonat-Puffer, pH 8.0 (oder Phosphatpuffer, pH 7.0) lösen. Dann 1% (w/w) Pronase E zugeben und 24 Stunden bei 37°C inkubieren.

Protokoll zur Isolierung primärer hämatopoetischer Stammzellen(HSCs) in Mäusen mittels Pronase E^[2]:

1. Männliche oder weibliche Mäuse wurden anästhesiert und die Bauchhöhlen geöffnet.

2. Die Leber wurde über die Pfortader mit Hanks' Buffered Salt Solution (HBSS) perfundiert, gefolgt von einer Perfusion mit Pronase E und Kollagenase.

3. Dann wurde die Leber vorsichtig mit einer sterilen Pinzette entnommen und in sterile Schalen überführt.

4. Die Leberkapsel wurde aufgerissen und die Leber vorsichtig geschüttelt, um die Zellen freizusetzen.

5. Die Zellen wurden in einer Lösung mit Pronase E, Kollagenase und DNase suspendiert und dann 20 Minuten bei 37℃ verdaut.

6. Die Hepatozyten wurden durch zweimaliges Zentrifugieren bei 50 g für 3 Minuten isoliert.

7. Der Überstand wurde zur Gewinnung von HSCs bei 450 g für 8 Minuten zentrifugiert. Dann wurden die Präzipitate in 18%iger Nycodenz-Lösung resuspendiert, um eine Dichtgradienten-Zentrifugation mit 12% Nycodenz, 8.2% Nycodenz und Gey's Balanced Salt Solution (GBSS) vorzubereiten.

8. Schließlich wurden die Zellen aus der 8.2%igen Nycodenz-Schicht isoliert, um HSCs zu gewinnen.

Das Protokoll dient nur als Richtlinie und sollte an Ihre spezifischen Bedürfnisse angepasst werden.

References:

[1]. Pronase E significantly increases the amount of most of the amino acids analysed ( PE vs C ) , especially Ile, His and Thr

[2].  Chen QT, Zhang ZY, et,al. HK1 from hepatic stellate cell-derived extracellular vesicles promotes progression of hepatocellular carcinoma. Nat Metab. 2022 Oct;4(10):1306-1321. doi: 10.1038/s42255-022-00642-5. Epub 2022 Oct 3. PMID: 36192599; PMCID: PMC9584821.