Méthode d'enregistrement en configuration Whole-Cell et de traçage de Biocytin
Ce protocole est adapté à partir de données de recherche et fourni à titre indicatif uniquement. Des ajustements peuvent être nécessaires selon les exigences expérimentales spécifiques.
(1)Préparation des réactifs et des électrodes : Préparer une solution intracellulaire contenant 0,1% de Biocytin (composants : 110mM de gluconate de potassium, 10mM de NaCl, 1mM de MgCl₂, 10mM EGTA, 40mM HEPES, 2mM Mg-ATP, 0.3mM Na-GTP, pH=7.3, 280-300mOsm de osmolarité). Ajuster la résistance des électrodes en verre selon la taille des neurones cibles (neurones épineux moyens : 6-8MΩ; neurones pyramidaux/interneurones à parvalbumine : 5-6MΩ), en veillant à ce que la pointe de l'électrode ne contienne pas de bulles.
(2)Préparation des tranches cérébrales et localisation des neurones : Prélève du tissu cérébral chez les rats âgés de 3 mois et prépare des tranches coronales contenant le cortex moteur primaire (M1) ou le striatum (épaisseur : 320µm) à l'aide d'un vibratome. Après une récupération de 1h dans un liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) oxygéné, transférer les traches dans une chambre de perfusion enregistreuse à température contrôlée (30°C). Identifier la morphologie neuronale par microscopie en contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR-DIC) (les neurones pyramidaux ont une forme de goutte de pluie, les neurones épineux moyens ont une forme ovale).
(3)Enregistrement en configuration Whole-Cell et chargement de Biocytin : Après que l'électrode entre en contact avec la membrane cellulaire, appliquer une pression négative pour former un joint gigahmique, puis appliquer brièvement une succion forte pour rompre la membrane et établir le mode Whole-Cell. Enregitrer les potentiels d'action (PA) en mode clamp courant, puis maintenir le mode Whole-Cell pendant 40 à 60 minutes pour permettre à biocytin de diffuser complètement dans les fines structures neuronales telles que les dendrites et les axones. Retirer lentement l'électrode pour permettre à la membrane de se refermer.
(4)Marquage tissulaire et fluorescence : Fixer les tranches cérébrales enregistrées dans une solution de paraformaldéhyde à 4% à 4°C pendant 24 heures. Après perméabilisation avec 1% Triton-X100, incuber avec des sondes fluorescentes streptavidine-Alexa 594 (rouge) ou Alexa 488 (verte) (dilution 1:1000) à 4°C pendant 24 heures.
(5)Imagerie morphologique et analyse : Utiliser un microscope confocal (objectif à immersion huile 63×) pour acquérir des images en pile Z des neurones (pas de séquençage : 0,2µm) sous les signaux fluorescents correspondants. Réaliser une reconstruction 3D à l'aide du logiciel Image J pour analyser la longueur dendritique totale, la complexité de la ramification (analyse de Sholl) et la densité des épines dendritiques (nombre d'épines par unité de longueur de dendrite).
Précautions :
(1)Les expériences doivent être conformes aux lignes directrices éthiques relatives aux animaux.
(2)Pour votre sécurité et votre santé, portez une blouse de laboratoire et des gants jetables pendant l'opération.
References:
[1] Tan S, Mo X, Qin H, et al. Biocytin-Labeling in Whole-Cell Recording: Electrophysiological and Morphological Properties of Pyramidal Neurons in CYLD-Deficient Mice. Molecules. 2023 May 15;28(10):4092. |
