D-Lin-MC3-DMA

Procédure expérimentale d'encapsulation de siRNA avec D-Lin-MC3-DMA  ^[1]

(1) Préparation des réactifs: D-Lin-MC3-DMA, 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine, le cholestérol et PEG-DMG (rapport molaire=50:10:38.5:1.5) sont dissous dans de l'éthanol pour préparer la phase organique. La concentration lipidique finale est de15μM. siRNA est dissous dans un tampon de citrate à 50mM(pH=4) pour préparer la phase aqueuse.

(2) Préparation des nanoparticules lipidiques (LNP): une solution éthanolique qui contient D-Lin-MC3-DMA (phase organique) et un tampon de citrate qui contient siRNA (aqueous phase) sont placés dans deux séringues distinctes. Les seringues sont raccordées aux entrées d'une puce microfluidique. Le rapport des débits est fixé à 3:1 et le débit total est de 12mL/min. Le rapport entre siRNA et D-Lin-MC3-DMA est de 21μg de siRNA per μmol de lipide cationique. Le lipide cationique représente 50% des lipides totaux en quantité molaire. Si un marquage fluorescent est nécessaire, 0.1% molaire du colorant lipophile DiI (DiIC18(3)) ( No. de catalogue GC33425) peut être ajouté.

(3) Purification et conjugation avec des anticorps: Après la préparation de LNP, les LNP sont immédiatement dialysées contre un tampon HN (10mM HEPES, 135mM NaCl, pH=6.9) à 4°C pendant une nuit afin d'éliminer l'éthanol. Pour préparer des LNP ciblées par des anticoprs, les anticorps sont conjugués aux groupements maléimide présents à la surface de LNP. Les LNP conjuguées sont purifiées par ultracentrifugation, puis dialysées contre un tampon HN (pH=7.4).

Précautions:

(1) La taille des particules de toutes les formulations de LNP est comprise entre 59 et 139nm, avec un indice de polydispersité ≤ 0.34.

(2) Les LNP peuvent préserver l'intégrite du siRNA après une conservation à 4°C durant 3 semaines.

(3) Pour assurer la sécurité lors de la manipulation, porter une blouse de laboratoire et des gants jetables.