Z-Gly-Gly-Arg-AMC acetate

Détection de l'activité thrombinique basée sur Z-Gly-Gly-Arg-AMC acetate^[1]

Ce protocole fournit seulement une lignée directrice; il doit être adapté selon vos besoins spécifiques.

1.Préparation des solutions

(1)Dissoudre le solide de Z-Gly-Gly-Arg-AMC acetate dans une quantité appropriée de DMSO pour préparer une solution de stock à 50mM. Conserver la solution de stock à -20°C et éviter les cycles répétés de congélation/décongélation.

(2)Diluer la solution de stock de Z-Gly-Gly-Arg-AMC acetate dans PBS pour préparer une solution de travail à 2,5mM. La solution de travail doit être préparée immédiatement et utilisée rapidement.

(3)Prendre une solution de CaCl₂ appropriée et la dissoudre dans le tampon de détection (contenant 20mM HEPES, 145mM NaCl, pH 7.5) pour préparer le tampon d'activation.

2.Test de génération de thrombine

(1)Mélanger le plasma avec la solution de stock de Z-Gly-Gly-Arg-AMC acetate dans un rapport volumique de 4:1, puis placer le mélange dans les puits d'une plaque de 96 puits à fond plat. Ajouter 100µl du mélange dans chaque puits. Ajouter 20µl de tampon d'activation dans chaque puits pour déclencher la réaction de coagulation. La concentration finale de Z-Gly-Gly-Arg-AMC acetate est 400µM.

(2)Mesuer la fluorescence en continu à 37°C à l'aide d'un lecteur de plaque fluorescent (Ex/Em=355/460nm) pendant 30 minutes, avec une lecture toutes les 3 minutes.

3.Consignes d'attention

(1)Z-Gly-Gly-Arg-AMC acetate est photosensible; le processus opératoire doit être réalisé à l'abri de la lumière.

(2)Pour éviter les bulles, la lecture doit être effectuée dans les 10 secondes suivant l'ajout du tampon d'activation (contenant CaCl₂).

References:
[1] Tarandovskiy I D, Artemenko E O, Panteleev M A, et al. Antiplatelet agents can promote two-peaked thrombin generation in platelet rich plasma: mechanism and possible applications[J]. PLoS One, 2013, 8(2): e55688.