Fluo-4 AM

このプログラムはあくまでもガイドであり、ご自分のニーズに合わせてご調整願います。

1.色素溶液の調製

（1）貯蔵液の構成：濃度が1-10mmのAMエステル貯蔵液を無水DMSOで調製された。

注：

②繰り返す冷凍と解凍を避けるために、包装後は未使用の貯蔵液を光から遠いところで-20℃または-80℃保存するべき；

② Fluo-4AMは湿気を吸収しやすいので、開ける前は乾燥した環境に室温で置いてください。明ける前は短く遠心分離し、粉がチューブの底に落ちることを確かめる。

（2）作業液の構成：適切な緩衝液（例えば：無血清、フェノールレッド培地またはPBS）で貯蔵液を希釈し、濃度が1-10μMの作業液を調製する。

注：

(1)Fluo-4 AM色素溶液を調製する場合、適切な量の20%のPluronic F-127溶液を貯蔵液に入れ、AMプローブの水溶性を増強させるべき；

②Pluronic F-127はFluo-4 AMが溶液で蓄積するのを阻止することができ、細胞へのより良いプローブの進入を促進する。しかし、PluronicF-127はAMプローブの安定性を減らせるので、作業溶液の調製中にPluronICF-127を添加することだけを推奨し、長期の保存には貯蔵液を添加すべきではない。

③ 20%(w/v)のPluronic F-127母液の調製：100mgのPluronic F-127粉末（番号：GB30090）の重量を測り、500μLのDMSOを添加し、40-50℃で20-30分間加熱し、室温で保存すべき。加熱で溶解できる結晶体があれば、それは使用には影響を与えない；

④（選択的）GLPBIOは溶解されたPluronic F-127（DMSOの中に20%の溶液）、製品番号：GB30091を提供する；

等量の20%のPluronic F-127溶液を貯蔵液に添加し、よってPluronic F-127の最終作業濃度は約0.02%である；

実際の条件に応じて作業液の濃度を調製し、繰り返した冷凍と解凍を避けるには直ちに使うべき。

2.細胞懸濁染色

（1）懸濁細胞：4℃、1000gで3-5分間遠心分離し、上清を廃棄し、PBSまたはその他の緩衝液で5分間ずつ二回洗浄する；

（2）接着細胞：PBSまたはその他の緩衝液を二回洗浄し、膵臓酵素消化細胞を添加し、消化後は1000gで3-5分間遠心分離する；

（3）細胞を色素溶液で再懸濁し、室温または室温以下で、暗闇で20分間から2時間培養する。異なる細胞に対する最適な培養時間は異なるので、特定の実験ニーズに合わせてご自分で研究してください；

注：

①殆どの細胞におけるAMエステル色素の推奨作業濃度は4-5μMであり、具体的な濃度は、実験要件に応じて最適化するべきである。オーバーロードによる細胞毒性を避けるためには、効果的な結果を得るのに基づいて、できるだけ一番低いプローブ濃度を使うのを推奨する。

②（選択的）細胞が有機アニオン輸送体を含有する場合、脱エステル化プローブの漏洩レベルを減らすには、prosulfasol (GC16825, Probenecid, 1-2.5mM)またはsulpyrone (GC11049, Sulfinpyrazone, 0.1-0.25mM)を細胞培地に添加する必要があるのかもしれない。貯蔵液はアルカリなので、pHは培地を添加したあとで再調整する必要がある；

③血清を含有する培地が使われたのなら、血清乳糖分解酵素はAMを降格させ、よって染色効果を減らす；フェノールレッドを含有する培地はバックグラウンド値をちょっとだけ高くさせ、色素溶液を添加する前に、非指示性培養培地で細胞を二三回洗浄することを推奨する。

④プローブのローディング温度を減らすことで、プローブの局所化を減らすことができるかもしれない。

（4）培養後、1000gで5分間遠心分離し、染色溶液を除去し、PBSまたはその他の緩衝液を添加して2-3回洗浄し、残留のプローブを除去する；

（5）室温で30分間培養し、細胞でAMの完全な脱エステル化を確保する。

3.細胞接着の染色

（1）接着細胞を無菌のカバーガラスで培養した；

（2）培地からカバーガラスを除去し、過剰の培地を吸い出し、カバーガラスを湿った環境に置く；

（3）100μLの染料作業溶液をカバーガラスの一角から添加し、ゆっくり振動し、全ての細胞が染料で均一にカバーされるようにする；

（4）室温または室温以下で、暗闇で20分間-2時間培養する。異なる細胞に対する最適な培養時間は異なるので、特定の実験ニーズに合わせてご自分で研究してください；

（5）培養の終了後、色素作業溶液を吸収、廃棄し、PBSまたはその他の緩衝液で2-3回カバーガラスを洗浄する；

（6）室温で30分間培養する。

4.顕微鏡検出：Fluo-4AMの最大励起/発光波長は494/506nmである。

注：

（1）作業液を構成しているときは、20%のPluronic F-127溶液を添加することを推奨し、その添加は水溶液におけるFluo-4 AMの分散性を増やすことができる。

（2）Fluo-4 AMの放出は、細胞培地にprosulfazol (GC16825, Probenecid, 1-2.5mM)またはsulpiridone (GC11049, Sulfinpyrazone, 0.1-0.25mM)を添加することで減らされることが可能である。貯蔵液はアルカリであるため、培地の添加後にはpHを再調整する必要がある。

(3) F luo-4 AMは湿気を吸収しやすい。冷蔵庫から取り出したあと、開ける前に、室温で乾燥した環境に置いてください。試薬の量が少ないので、開ける前には、粉がチューブの底に落ちているのを確かめるために短く遠心分離してください。

（4）F luo-4 AMは水中では分解しやすい。一回では使い切れないのであれば、包装して保存することを推奨する。例えば、5μl/チューブに包装し、シーリングフィルムで封印し、アルミニウムホイルで包み、密閉したプラスティックバッグに入れ、乾燥バッグに入れ、≤-20 ° Cで封印し、光から遠ざけて保存する。

（5）本格的な実験の前に、適切な実験条件を探しだすためには、細胞の数、カルシウムイオン蛍光プローブの最終濃度、培養時間などを探し出すことを推奨する。

（6）蛍光色素はみな消光の問題がある。それを遅らせるためには、できるだけ光から避けてください。

（7）蛍光培養の前に、細胞の表層に結合する非特異的な色素を除去するためには、指示薬なしの培地で細胞を洗浄するべきである。