Hoechst 34580

Hoechst 34580に基づいた検出法

このプロトコールはガイドラインのみを提供し、ご自分の特定のニーズに合わせてご調整ください。

1.染色溶液の調製

（1）原液の調製：高品質の無水DMSOで、濃度が1mMのHoechst 34580原液を調製する。注：未使用の原液を分注し、暗所、-20℃で保存し、よって繰り返された冷凍と解凍を避ける。

（2）作業溶液の調製：PBSで原液を希釈し、濃度が1μMの作業溶液を調製する。繰り返された冷凍と解凍を避けるために、実際の状況に応じて作業溶液の濃度を調整し、使用の直前に調製してください。注：作業溶液は、実験の当日に新鮮に調製しなければならない。

2.細胞標識（接着細胞）

（1）14mmのガラス底の培養皿で、70-80%のコンフルエンスになるまで、細胞を培養する。

（2）0.05%のトリプシン-EDTAを添加する；37℃、細胞が丸くなるまで、3分間インキュベートする。皿を軽く叩き、10% FBSを含有する2mlの培地でプロテアーゼを抑える。

（3）15mlのチューブに細胞懸濁液を移す；2ml PBSで培養皿をすすぐ。遠心分離（1000g；4°C；5分間）し、上清を廃棄する。

（4）温かいPBSで二回洗浄する。

（5）カバーガラスごとに100µlの作業溶液を添加し、4℃、氷の上で20分間インキュベートする。

（6）染料を除去し、冷PBSで二回洗浄し、イメージングまたはフローサイトメトリーのためにPBSで再懸濁する。

3.細胞の標識（懸濁細胞）

（1）1×10⁶個の細胞を採取し、冷PBSで二回洗浄する。

（2）1ml 1µMの作業溶液で再懸濁し、室温で光を避けて20分間静置する。

（3）二回洗浄し（1000g；4°C；3分間）、イメージングまたはフローサイトメトリーのためにPBSで再懸濁する。

4.注意事項：

（1）蛍光染料には全て消光の問題がある。蛍光の消光を遅らせるためには、光からできるだけ避けてください。

（2）ご自分の安全と健康のために、操作時は白衣と使い捨ての手袋をご装着ください。

（3）実験の間に、BODIPY FL C5-Ceramideは暗所で保存するべきである。

（4）このプロトコールと全ての試薬は、科学研究のみに使うべきである。

References:

[1] Abdollahi E, Taucher-Scholz G, Jakob B. Application of fluorescence lifetime imaging microscopy of DNA binding dyes to assess radiation-induced chromatin compaction changes[J]. International journal of molecular sciences, 2018, 19(8): 2399.