ARCA

ARCA를 사용해서 올바른 방향의 캡 구조를 가진 mRNA를 제조하는 방법^[1]

본 프로토콜은 참고용으로만 제공됩니다. 실제 필요에 따라 조정하시기 바랍니다.

(1) 시약 준비: ARCA를 물 또는 적절한 버퍼에 용해해서 0.5 mM 스톡 용액을 제조합니다. 0.5 mM ATP, 0.5 mM CTP, 0.5 mM UTP 및 0.1 mM GTP가 포함된 NTP 혼합물을 준비합니다 (ARCA 대 GTP의 몰 비율 5:1). SP6 또는 T7 RNA 폴리머라제, DNA 주형, RNase 억제제 및 전사 버퍼를 준비합니다.

(2) 체외 전사 반응 체계 구축: 전사 버퍼에 600 ng의 DNA 주형, 1 U/μL RNase 억제제, 0.5 mM ATP/CTP/UTP, 0.1 mM GTP 및 0.5 mM ARCA를 첨가합니다. 이 후에 SP6 또는 T7 RNA 폴리머라제를 첨가합니다.

(3) mRNA 합성: 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 2 μL의 DNase를 첨가한 후 주형 DNA를 제거하기 위해 37°C에서 20분 동안 배양합니다. RNA 산물을 정제하고 올바른 방향을 가진 ARCA 캡 구조의 mRNA를 얻습니다.

(4) ARCA 캡 결합 mRNA의 번역 검증: ARCA 캡 결합 mRNA를 HEK293 세포(DMEM + 10% FBS; 37°C; 5% CO₂)에 형질 전환하거나 토끼 망상적혈구 용해액을 첨가해서 30°C에서 60분 동안 배양합니다. 루시페라제 발광 값을 통해 번역 효율을 평가합니다. RT-qPCR을 통해 HEK293 세포 내 잔류 mRNA 비율을 검출해서 안정성을 평가합니다.

주의 사항:

(1) RNA 분해를 방지하기 위해 실험 전반에 걸쳐 RNase-free 소모품을 사용해서 모든 조작은 얼음 위에서 수행해야 합니다.

(2) 안전과 건강을 위해 작업할 때 실험복과 일회용 장갑을 착용하시기 바랍니다.