DBCO-NHS ester

이 프로토콜은 DBCO-NHS ester로 수정된 단백질과 아지드 염료의 구리 없는 클릭 반응에 대해 설명합니다. 실제 지원 조건은 연구 설계에 따라 최적화할 필요가 있을 수 있습니다[1-2].

1.시약 및 재료 준비

DBCO-NHS ester, 대상 단백질, 아지드 수정 형광 염료, PBS, 탄산 버퍼.

2. 실험 단계

(1) 단백질의 DBCO 변형

대상 단백질을 pH 8.5의 탄산 버퍼에 1 mg/mL 이상의 농도로 녹입니다. DBCO-NHS ester를 무수 DMSO에 녹입니다(표시 용액 중 DMSO의 최종 농도를 10% 이하로 유지합니다)그리고 DBCO:단백질 비율을 5-20:1로 하여 단백질 용액에 추가합니다. 소용돌이를 이용해서 혼합하고 실온에서 2시간 동안(또는 4℃에서 밤새) 어두운 곳에서 배양합니다. 예냉각된PBS(pH 7.4)로 제염 칼럼을 평형시킨 후 반응 용액을 칼럼에 올리고 원심분리에 의해 정제된 단백질을 수집합니다. 단백질 농도를 측정하고 분할해서 -80℃에서 동결보관합니다.

(2) DBCO-아지드 클릭 반응

DMSO를 사용해서 아지드 염료(예: 아지드-Cy5)의 1-10 mM 원액을 준비하고 어두운 곳에서 보관합니다. DBCO 수정 단백질과 아지드 염료를 PBS(pH 7.4)에서 DBCO:아지드 = 1:1.5-3(몰 비율)로 혼합합니다. 소용돌이를 이용해서 혼합하고 실온에서 1-4시간 동안(또는 4℃에서 밤새) 어두운 곳에서 반응을 시킵니다. 탈염 칼럼이나 투석(PBS, 4℃, 어두운 곳)를 사용해서 자유 염료를 제거합니다. SDS-PAGE(형광 스캐)또는 UV-c보이는 분광학(염료/단백질 비율, DOL 계산)를 사용해서 분석합니다.

주의사항 및 주의사항

(1) 무수 작동: DBCO-NHS ester는 수분에 의해 쉽게 가수분해되고 건조한 환경에서(질소로 터는 DMSO에 녹임) 녹여야 합니다.

(2) 몰 비율 최적화: 높은 DBCO 비율은 단백질 응집을 일으킬 수 있고 5:1, 10:1, 15:1의 순서 별로를 먼저 테스트하는 것이 좋습니다.

(3) 빛 보호 및 저온: DBCO와 형광 염료는 모두 빛에 민감하고 전체 과정은 빛을 피해야 합니다. 정화는 4℃에서 수행됩니다.

(4) 간섭 회피: 반응 시스템이 티올(예: DTT, β-메르캅토에탄올)이나 아지드를 포함하는 버퍼로 오염되지 않도록 합니다.

(5) 세포 실험 확인: 생체 세포 표시에 사용할 경우, 수정된 단백질의 생물학적 활성과 아지드 염료의 세포 투과성을 확인해야 합니다.

References:
[1]. Ciferri MC, Bruno S, Rosenwasser N, et al. Standardized method to Functionalize plasma-extracellular vesicles via copper-free click Chemistry for targeted drug delivery strategies. ACS Applied Bio Materials. 2024 Jan 16; 7(2): 827-838.
[2]. Lee HJ, Fernandes-Cunha GM, Putra I, et al. Tethering growth factors to collagen surfaces using copper-free click chemistry: surface characterization and in vitro biological response. ACS applied materials & interfaces. 2017 Jul 19; 9(28): 23389-23399.