Hoechst 33342

이 계획은 단지 가이드를 제공하고 구체적인 요구에 맞게 수정해 주세요.

1.Hoechst 33342 염색 용액 준비

(1) Hoechst 33342 염료 저장 용액 준비: DMSO를 사용하여 Hoechst 33342 고체를 녹여 10 mg/mL의 Hoechst 33342 염료 저장 용액을 준비합니다.

참고: Hoechst 저장 용액은 반복적인 냉동 및 해동을 피하기 위해 -4°C나 -20°C의 어두운 곳에 분사하여 저장하는 것이 권장됩니다.

(2) 작업 용액 준비: 예열된 세럼이 없는 매체나 버퍼 (HBSS나 PBS 등)를 사용하여 저장 용액을 희석하여 10 μg/mL 농도의 Hoechst 33342 작업 용액을 준비합니다.

참고: 실제 상황에 따라 Hoechst 작동액의 농도를 조정하고 즉시 준비해 주세요.

2.세포 염색

2.1 흡수 세포 (6웰 판을 예로 들음)

(1) 원심분리기는 세포를 1000g에서 3-5분간 정지시켰습니다. 상청액을 버리고 PBS로 두 번 씩 5분간 세척합니다.

(2) Hoechst 33342 염료 작업 용액 1 mL을 추가하여 실내 온도에서 어두운 곳에서 5-10분간 배양합니다.

(3) 배양 후 1000g 로 5분간 촤속하여 상청액을 제거하고 PBS를 추가하여 2-3번 씩 5분간 헹궈냅니다.

(4) 무혈청 세포배양액이나 PBS를 사용하여 세포를 소생시키고 형광 현미경이나 흐름 세포계측기로 관찰합니다.

2.2 피복층 세포

(1) 병원용 표본용 슬립에 피복층 세포를 재배합니다.

(2) 재배액에서 표본용 슬립을 제거하고 불필요한 재배액을 빨아들여 표본용 슬립을 습한 환경에 배치합니다.

(3) 표본용 슬립의 한 모퉁이에 Hoechst 33342 염료 작업 용액 100μL을 추가하고 살짝 흔들어 염료가 모든 세포를 균등하게 덮도록 한 후, 실내 온도에서 어둠에서 5-15분 동안 배양합니다.

(4) 염료작업용액을 흡입하여 표본용 슬립을 배양액으로 2~3번 헹궈내고 형광현미경으로 관찰합니다.

3. 현미경 탐지: Hoechst 33342의 자극/방출 광선은 각각 350/461nm입니다.

예방 조치:

① 고정된 세포나 조직 샘플의 염색은 고정 후에 씻어 고정제를 제거해야 합니다;

② Hoechst 33342 염색은 보통 다른 염색 후에 실시됩니다. 다른 염색이 필요하지 않으면 Hoechst 33342 염색을 직접 실시합니다;

③ 형광 억제를 늦추기 위해 형광방지 억제마운팅 에이전트를 사용하는 것이 추천됩니다;

④ 모든 형광 염료는 꺼짐 문제가 있으니 빛을 피해 주세요;

⑤ Hoechst 33342는 인체에 자극적으로 안전과 건강을 위해 조작할 때 실험복과 일회용 장갑을 착용해 주세요.

참고문헌:

[1]. Lisa C Crowley, Brooke J Marfell , Nigel J Waterhouse. Analyzing Cell Death by Nuclear Staining with Hoechst 33342. 2016 Sep 1;2016(9). doi: 10.1101/pdb.prot087205.