Hoechst 34580

Hoechst 34580 기반 검출 방법

이 프로토콜은 지침만 제공하고 특정 필요에 따라 수정하시기 바랍니다.

1.염색액 준비

(1) 저장 용액 준비: 고품질 무수 DMSO에서 농도 1mM의 Hoechst 34580 저장 용액을 준비합니다. 주의: 사용하지 않은 저장액을 분주해서 -20°C에서 암소 보관하고 반복적인 동결 및 해동을 피하도록 합니다.

(2) 작업 용액 준비: PBS로 저장액을 희석해서 농도 1μM의 작업액을 준비합니다. 실제 상황에 따라 작업 용액 농도를 조절하고 반복적인 동결 및 해동을 피하도록 합니다. 주의: 작업 용액은 실험 당일 신선하게 준비해야 합니다.

2. 세포 표지 (부착 세포)

(1) 14mm 유리 바닥 배양 접시에서 세포를 70-80% 융합도까지 배양합니다.

(2) 0.05% 트립신-EDTA를 첨가하고; 37°C에서 3분간 배양해서 세포가 둥글어질 때까지 기다립니다. 배양 접시를 부드럽게 두드리고 10% FBS를 함유한 2ml 배지로 단백분해효소를 중화시킵니다.

(3) 세포 소생된 용액을 15ml 튜브로 옮기고; 잔여 세포를 회수하기 위해 2ml PBS로 배양 접시를 헹굽니다. 원심분리기 (1000g; 4°C; 5분); 상청액을 폐기합니다.

(4) 따뜻한 PBS로 두 번 세척합니다.

(5) 입체 현미경당 100µl 작업 용액을 첨가하고 얼음 위에서 4°C에서 20분간 배양합니다.

(6) 염료를 제거하고 차가운 PBS로 두 번 세척한 후 현미경 촬영 또는 유세포 측정법을 위해 PBS에 소생시킵니다.

3. 세포 표지 (소생된 세포)

(1) 1×10⁶ 세포를 적출해서 차가운 PBS로 두 번 세척합니다.

(2) 1ml 1µM 작업 용액에 소생시키고 빛을 차단한 상태에서 실온에서 20분간 처리합니다.

(3) 두 번 세척(1000g; 4°C; 3분)한 후 현미경 촬영 또는 유세포 분석을 위해 PBS에 소생시킵니다.

4. 주의 사항:

(1) 형광 염료는 모두 소광 문제가 있습니다. 형광 소광을 늦추기 위해 가능한 한 빛을 피하도록 합니다.

(2) 안전과 건강을 위해 조작할 때 실험복과 일회용 장갑을 착용합니다.

(3) Hoechst 34580은 실험 전 과정에서 암소 보관해야 합니다.

(4) 이 프로토콜 및 모든 시약은 과학 연구 목적으로만 사용합니다.

References:

[1] Abdollahi E, Taucher-Scholz G, Jakob B. Application of fluorescence lifetime imaging microscopy of DNA binding dyes to assess radiation-induced chromatin compaction changes[J]. International journal of molecular sciences, 2018, 19(8): 2399.