Propidium iodide

Propidium iodide 염색 절차 [1]

플루오로크롬 용액: 0.1%의 구연산나트륨（중량/용량），0.1%의 트리톤 X-100（용량/용량）， 50mg/L의 Propidium iodide가 포함된 구이온/증기 증류수. 플루오로크롬 용액은 4°C의 어두운 곳에서 수개월간 보관할 수 있습니다.

DNA 염색 용액: 10ml의 PBS에 200μg의 Propidium iodide을 녹입니다. 2mg의 DNase가 없는 RNase를 추가합니다.

CRITICAL：사용하기 직전에 신선한 염색 용액을 준비합니다.

12×75튜브에 PBS 1ml을 사용하여 1-2×10^6cells/ml의 세포 농도로 소생시켜 주세요. 상온에서 200g으로 5분간 원심분리합니다.

PBS를 흡인합니다.

종균 및 비부착성 단핵세포(옵션 A) 그리고 정지 상태에서 성장하는 다핵세포와 부착성 세포(옵션 B) 에 대해 빠른 방법과 표준 방법을 따릅니다.

빠른 방법(PI 저온해성 용액에서 직접 DNA 염색)

i) 세포 공을 1ml의 플루오로크롬 용액에서 살짝 다시 소생시킵니다.

ii) 유세포 분석 전에 튜브를 4°C의 어두운 곳에 놓아두어야 하고 최소 1시간에서 최대 24시간이내로 합니다.

참고: 핵 염색에 적당한 시간은 1시간이고 세포는 4°C의 어두운 곳에서 24시간 동안 보관할 수 있고 DNA 프로파일에 실질적인 변화가 없습니다.

B. 표준 방법（알코올 고정 후 PI 염색）

i) 500μl의 PBS에서 세포 덩어리를 다시 소생시켜 주세요.

ii) 세포소생액에 70%(v/v)의 차가운 에탄올 4.5ml을 추가하여 세포를 고정시키된 튜브은 얼음 위에 놓아주세요.

PAUSE POINT: 세포는 −20°C의 에탄올 용액에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다.

iii) 400g으로 5분간 원심 분리하고 상층액(에탄올 용액)을 제거하세요.

iv) 5ml의 PBS로 세포를 세척어 400g으로 5분간 원심 분리합니다.

CRITICAL STEP: DNA가 심각하게 분해된 세포는 더 이상 처리하지 않고 직접 DNA 염색 용액에서 다시 소생시킬 수 있습니다.

v) DNA가 심각하게 분해되지 않았다면 세포를 0.5ml의 PBS에서 다시 소생시킨 후 0.5ml의 DNA 추출 버퍼를 추가하세요. 방온에서 5분간 배양 후 400g으로 5분간 원심 분리합니다.

vi) 상층액을 제거하고 세포를 1ml의 DNA 염색 용액에서 다시 소생시킵니다.

vii) 다시 소생된 세포를 방온에서 어두운 곳에 최소 30분간 배양합니다.

유세포를 사용하여 세포를 분석하세요. 488nm 레이저 선을 사용하여 자극합니다. 적색 형광(600nm 이상)와 사이드 스카터를 측정하세요. 최소 20,000개의 이벤트를 수집하세요. 남아 있는 잔해를 제외하세요. 저배체 및 이배체 DNA 정점을 측정합니다.

이 프로토콜은 지침을 제공하고 사용자의 구체적인 필요에 따라 수정되어야 합니다.