인용 문헌 (Citations)
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TBTA(트리(벤지릴트리아조릴메틸)아민)은 1,2,3-트리아졸 그룹을 포함하는 터시아민이다. TBTA는 구리(I)와 복합물을 형성하고 구리(I) 산화상태를 안정화하여 클릭 반응 촉매를 촉진한다. TBTA는 구리 촉매를 사용한 아지드-알키인 사이클로에이션(CuAAC)에서 가장 널리 사용되는 수용성이 없는 리간드 중 하나이다[3].
클릭 화학은 다양한 첨합물을 합성하는 데 사용할 수 있는 다목적 반응이다. 거의 모든 생물분자는 클릭 화학 방법을 사용하여 형광 염료, 비오틴 등과 같은 소분자로 쉽게 표시될 수 있다.
클릭 화학 반응은 두 가지 성분 사이에서 발생한다: 아지드와 알키인(터미널 아세틴). 아지도 및 알키인 그룹은 자연 생물분자에서 거의 발견되지 않는다. 따라서 이 반응은 매우 생물 정교하고 특이성이 높은다.
References:
[1] Alireza Movahedi, et al. One-pot synthesis of TBTA-functionalized coordinating polymers. Reactive and Functional Polymers.2014. 82:1-8.
[2] Kennedy D C, McKay C S, Legault M C B, et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions[J]. Journal of the American Chemical Society, 2011, 133(44): 17993-18001.
[3] Hagmann V, Sommer S, Fabian P, et al. Chemically monoubiquitinated PEX5 binds to the components of the peroxisomal docking and export machinery[J]. Scientific Reports, 2018, 8(1): 16014.
실험 프로토콜 (Protocol)
이 계획은 단지 가이드를 제공합니다. 특정 요구 사항에 맞게 수정하십시오.
1. 아래 표를 사용하여 클릭 화학 표시를 위한 반응물질의 용량을 계산하십시오. 필요한 재료 용액을 준비하십시오(부록 참조).
2.밀폐된 비닐에 워터에서 알키인-수정된 올리고뉴클레오티드나 DNA를 용해합니다.
3.최종 농도 0.2M에 2M 트리에틸아민산산 버퍼, pH 7.0을 추가합니다.
4.DMSO를 추가하고, 버킷으로 혼합합니다.
5.아지드 저장 용액(DMSO에 10 mM)을 추가하고, 버킷으로 혼합합니다.
6.혼합물에 5mM 아스코르빗산 저장 용액의 필요한 용량을 추가하고, 짧게 버킷믹스합니다.
7.30초 동안 불활성 기체를 뿜어내면서 용액을 공기정화합니다. 질소, 아르곤, 또는 헬륨을 사용할 수 있습니다.
8.10 mM 구리(II)-TBTA 저장 용액(55% DMSO)의 필요한 양을 혼합물에
부록.클릭 화학 라벨링 및 활용에 사용되는 시약의 재고 용액 준비.
9.혼합물을 철저히 버킷 혼합합니다. 아지드의 중요한 침전이 관찰되면, 비닐을 80℃에서 3분간 가열하고 버킷 혼합합니다.
10.밤새 상온에 보관하세요.
11.올리고뉴클레오티드에는 아세톤(oligonucleotides용) 또는 이소프로판올(DNA용)을 사용하여 첨합물을 침전시킵니다. 철저히 혼합하고 -20°C에서 20분간 유지합니다.
올리고뉴클레오티드 첨합물 침전: 혼합물에 최소한 3% 리튬 과염소산 아세톤의 4배 과잉량의 용액을 추가합니다(혼합물의 용량이 크면, 여러 비닐에 나누어 둡니다). DNA 첨합물 침전: 혼합물에 최종 농도 0.3M의 소다 아세트를 추가하고; 2.5배의 이소프로판올(또는 0.8배의 이소프로판올)을 추가합니다.
12.10,000 rpm로 10분간 센트리후지다.
13.상청을 버리고, 1mL 아세톤으로 펠렛을 세척한 후, 10,000 rpm로 10분간 센트리후지다.
14.상청을 버리고, 펠렛을 건조시키고 RP-HPLC 또는 PAGE를 통해 첨합물을 정제합니다.
부록. 클릭 화학 표시 및 첨합을 위해 사용되는 반응물질의 저장 용액을 준비합니다.
| 5 mM 아스코르빗산 저장 용액 | |
제조 | 아스코르빗산 18mg을 20mL의 증류수에 용해합니다. |
저장 | 아스코르빗산은 공기로 쉽게 산화됩니다. 이 용액은 하루 동안 안정하면 신선하게 제조된 용액을 사용하십시오. |
| 10 mM 구리(II)-TBTA 저장 용액(55% DMSO) | |
제조 | 50mg의 구리 (II) 아연산화물 펜타하이드레이트를 10mL의 증류수에 용해합니다. 116 mg의 TBTA 리간드를 11밀리리터의 DMSO에 용해합니다. 두 용액을 혼합합니다. |
저장 | 방온에서 보관하세요. 이 용액은 수년간 안정적으로 보존될 수 있습니다. |
2M 트리에틸아민산산 버퍼, pH 7.0 | |
제조 | 2.78 mL의 트리에틸아민을 1.14mL의 아세트산과 혼합합니다. 물을 10 mL의 용량에 추가하고, pH를 7.0으로 조정합니다. |
저장: 방온에서 보관하세요. 이 용액은 수년간 안정적으로 보관될 수 있습니다. | |
제품 문서 (Product Documents)
화학적 특성 (Chemical Properties)
저장 용액은 -80°C 보관 시 6개월 이내, -20°C 보관 시 1개월 이내에 사용하십시오.
용해도를 높이려면 튜브를 37°C로 데운 뒤 적절한 시간 동안 초음파 처리하십시오.
계산 도구 (Calculators)몰 농도 / 희석 / 분자량 / 단위 변환 / 생체 내 제형 / 용해도
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