Biocytin

Método de registro y rastreo de células enteras de Biocytin 

Este protocolo está adaptado a partir de datos de investigación y se proporciona solo como referencia. Los ajustes pueden ser necesarios en función de requisitos experimentales específicos. 

(1) Preparación de reactivos y electrodos: Prepare una solución intracelular que contenga biocytin al 0.1% (componentes: 110mM K-gluconate, 10mM NaCl, 1mM MgCl₂, 10mM EGTA, 40mM HEPES, 2mM Mg-ATP, 0.3mM Na-GTP, pH=7.3, osmolarity 280-300mOsm). Controle la resistencia del electrodo de vidrio de acuerdo con el tamaño de la neurona objetivo (neuronas espinosas medias: 6-8MΩ; neuronas piramidales/internauronas de parvalbúmina: 5-6MΩ), asegurando que la punta del electrodo esté libre de burbujas.

(2) Preparación de cortes cerebrales y localización de neuronas: Obtenga tejido cerebral de ratones de 3 meses de edad y prepare cortes coronales que contengan la corteza motora primaria (M1) o el cuerpo estríado (320μm de espesor) utilizando un vibrátomo. Después de recuperarse en líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado (aCSF) durante 1 hora, transfiera las rebanadas a una cámara de registro de perfusión controlada termostáticamente (30°C). Identifique la morfología neuronal utilizando la microscopía de contraste de interferencia diferencial infrarroja (IR-DIC) (las neuronas piramidales tienen forma de lágrime, las neuronas espinosas medias son ovalas).

(3) Grabación de células enteras y carga de Biocytin: después de que el electrodo entre en contacto con la membrana celular, aplique presión negativa para formar un sello de gigaohm, luego aplique brevemente una fuerte succión para romper la membrana y establecer el modo de toda la célula. Registre los potenciales de acción (AP) en modo de pinza de corriente, luego mantén el modo de célula completa durante 40-60 minutos para permitir que la Biocytin se difunda en estructuras neuronales finas como dendritas y axones. Retire lentamente el electrodo para permitir que la membrana se vuelva a sellar.

(4) Fijación de tejidos y tinción por fluorescencia: Fije las rebanadas cerebrales registradas en paraformaldehído al 4% a 4°C durante 24 horas. Después de la permeabilización con 1% de Triton-X100, incube con sondas fluorescentes streptavidin-Alexa 594 (rojo) o Alexa 488 (verde) (diluido 1:1000) a 4°C durante 24 horas.

(5) Imágenes y análisis morfológicos: Utilice un microscopio confocal (objetivo de inmersión en aceite de 63×) para adquirir imágenes de pila Z de neuronas (tamaño de paso 0.2μm) bajo las señales de fluorescencia correspondientes. REalice una reconstrucción 3D utilizando el software ImageJ para analizar la longitud dendrítica total, la complejidad de la ramificación (análsiis de Sholl) y la densidad d ela espina dendrítica (número de espinas por unidad de longitud de dendrita).

Precauciones:

(1) Los experimentos deben cumplir con las directrices de ética animal. 

(2) Por su seguridad y salud, por favor use una bata de laboratorio y guantes desechables durante la operación.