DDAO

Este plan solo proporciona una guía, por favor modifíquela para satisfacer sus necesidades específicas.

1. Preparación de la solución

(1) Solución de stock: Disolver DDAO en DMSO para preparar una solución de stock con una concentración de 5mM.

Nota: Después de que la solución de stock no utilizada se haya alícuota, guárdela a -20°C o -80°C en la oscuridad para evitar la congelación y descongelación repetidas.

(2) Solución de trabajo: Antes del experimento formal, diluya la solución original con un tampón adecuado (como medio libre de suero o PBS) a la concentración de trabajo requerida, como 1μM.

Nota: Por favor, ajuste la concentración de trabajo óptima de acuerdo con la situación real o consulte la literatura para establecer la concentración de gradiente usted mismo. La solución de trabajo debe prepararse y utilizarse de inmediato.

2. Uso de DDAO para estudiar el efecto fagocítico de los macrófagos en las células cancerosas^[1](de la literatura, solo como referencia)

(1) 0.8×10⁶ celdas RAW264.5 o 1×10⁶ THP1 se sembraron en placas de 6 pozos.

(2) Después de la incubación durante 24h, las células RAW264.7 se trataron con lipopolisacáridos (LPS) de 0.1μg/mL durante 24 horas para activarlas. Las células THP1 se diferenciaron mediante tratamiento con 40nM de forbol 12-myristate 13-acetate (PMA) durante 48h.

(3) Los macrófagos activados se tiñeron con DiO (Cat. No. GC19515) a una concentración final de 40nM en medio de cultivo durante 20 minutos y luego enjuagado tres veces con medio de cultivo.

(4) Las células cancerosas se etiquetaron con 1μM DDAO (5mM de stock, DMSO, almacenado a −20°C) en PBS a 37°C durante 15 minutos y luego se lavaron con PBS que contenía 1% de FBS.

(5) Las células diana marcadas con DDAO (1×10⁶) se añadieron a macrófagos teñidos con DiO (Mφ) y se incubaron a 37°C en un volumen final de 2mL durante 2h.

(6) Después de la incubación, el Mφ y las células diana se cosecharon lavando tres veces con EDTA-PBS y luego se digirieron con tripsina al 0.25%.

(7) La citometría de flujo se utilizó para evaluar las células de doble marcado (DIO⁺/DDAO⁺), que representan células cancerosas envueltas por Mφ maduro.

3. Uso de DDAO para estudiar la proliferación de células B ^[2](de la literatura, solo como referencia)

(1) Las células B se etiquetaron con 1μM DDAO y se cultivaron en RPMI completo suplementado con 4μg/mL CD40L, 100ng/mL BAFF, 1μg/mL anti-IgM or 2.5μg/mL CpG.

(2) Después de 3 días de cultivo, la dilución de DDAO (y la expresión de mCherry en células B dirigidas a CRISPR) se midió mediante citometría de flujo.