PPACK (Synonyms: Pebac, D-Phenylalanyl-prolyl-arginyl Chloromethyl Ketone)

Fibroblastos sinoviales de osteoartritis humana (OASF)

Método de preparación

El caldo de trombina se diluye en un baffer apropiado para obtener una solución de 20 ml a una concentración de 3-5×10^-10 M.Se incubaron alícuotas de 980 μL en las cubetas en una cámara celular con temperatura controlada por espectrofotómetro para lograr el equilibrio térmico.La inhibición de la trombina se inició inyectando 10 μL de 1.1 × 10^-7 to 3.65 × 10^-7 M PPACK solución y mezcla.Incube la mezcla de la reacción inmediatamente a intervaleos de 15a y 200s,luego agregue rápidamente 10 μL de solución de sustrato 3-5×10^-3 M en DMSO para medir la actividad enzimática restante.La constante de velocidad de pseudo-primer orden se calculó ajustando la función exponencial al tiempo de inhibición de la actividad enzimática restante frente a10 tiempos de incubación consecutivos.La actividad de la trombina se mantuvo constante surante el experimento en un rango de la temperatura de 288-328 k.

Áreas de aplicación

PPACK es un potente inhibidor selectivo e irreversible de la trombina que inhibe la alfa trombina humana con un valor de Ki de 0,24nM.

Líneas celulares

Los células endoteliales aórticas bovinas

Método de preparación

Las monocapas de las células endoteliales aórticas bovinas confluentes se obtuvieron de tres a cinco días después de la siembra en las placas del grupo de membrana de policarbonato.Las células setrataron con plasminógeno y un activador del plsminógeno.Se agregaron PPACK a los compartimentos superiores.Posteriormente,las monocapas se incubaron durante dos horas en una atmósfera de 5% CO₂ / 95% O₂ .

Condiciones de reacción

Áreas de aplicación

La coincubación con PPACK redujo el aumento de la permeabilidad endotelial inducida por la plasmina en un 59%.

Líneas celulares

Método de preparación

Las células fueron tratadas con tromina (3 U/ml), trombina más PPACK (30 nM) durante24 horas.

Condiciones de reacción

Áreas de aplicación

El pretratamiento de las células con PPACK antagonizó eficazmente el efecto potenciador de la trombina sobre la expresión de HO-1.

Modelos animales

Método de preparación

PPACK se preparó en la solución salina y se administró como una dosis en bolo de 10-100 μg/kg o como una influsión de 0.25-1.0 μg/kg/min.Los conejos fueron tratados con bolo PPACK 1 minuto antes o después de la administración de la trombina o se les infundió PPACK a partir de 30 minutos antes de la administración de la trombina y continuaron durante 1 h a una velocidad de 0.1 mL/min.

Áreas de aplicación

El pretratamiento con PPACK puede inhibir la tromboembolia cerebral inducida por trombina en los conejos.

References:

[1]. Kovach IM, Kelley P, et,al. Proton bridging in the interactions of thrombin with small inhibitors. Biochemistry. 2009 Aug 4;48(30):7296-304. doi: 10.1021/bi900098s. PMID: 19530705; PMCID: PMC2800789.

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