DDAO

이 계획은 단지 가이드를 제공하고 특정 필요에 따라 수정하시기 바랍니다.

1.용액 준비

(1) 원액: DDAO를 DMSO에 녹여 5 mM 농도의 원액을 준비합니다.

노트: 사용되지 않은 원액을 분할하고 -20°C 또는 -80°C의 어두운 곳에서 보관합니다. 반복적인 동결과 해동을 피하도록 합니다.

(2) 작업 용액: 공식 실험 전에 적절한 버퍼(예: 무혈청 배지 또는 PBS)로 원액을 필요한 작업 농도로 희석합니다. 예를 들어 1μM 등입니다.

노트: 실제 상황에 따라 최적의 작업 농도를 조정하거나 문헌을 참고하고 농도 계단을 직접 설정합니다. 작업 용액은 즉시 준비하고 사용해야 합니다.

2. DDAO를 사용하고 대식세포가 암세포를 흡수하는 효과를 연구합니다[1](문헌에서 가져온 것으로 참고용만 합니다)

(1) 6웰 판에 0.8×10⁶ RAW264.5 세포나 1×10⁶ THP1 세포를 심었습니다.

(2) 24시간 배양 후 RAW264.7 세포는 0.1μg/mL 지질 다당류(LPS)로 24시간 처리하여 활성화되었습니다. THP1 세포는 40 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)로 48시간 처리하고 분화되었습니다.

(3) 활성화된 대식세포는 배양액에서 최종 농도 40 nM의 DiO(제품 번호: GC19515)로 20분간 염색하고 배양액으로 세 번 헹구었습니다.

(4) 암세포는 37°C에서 15분 동안 1μM DDAO(5 mM 원액, DMSO, -20°C 보관)로 PBS에서 표지하고 1% FBS를 포함하는 PBS로 세척했습니다.

(5) DDAO로 표지된 대상 세포(1×10⁶)를 DiO로 염색된 대식세포(Mφ)에 추가하고 최종 부피 2 mL로 37°C에서 2시간 동안 배양했습니다.

(6) 배양 후 Mφ와 대상 세포는 EDTA-PBS로 세 번 세척하고 수확하고0.25% 트립신으로 소화했습니다.

(7) 유세포분석기를 사용하고 이중 표지된 세포(DiO⁺/DDAO⁺)를 평가했는데 성숙한 Mφ에 의해 흡수된 암세포를 나타냅니다.

3. DDAO를 사용하고 B 세포의 증식을 연구합니다[2](문헌에서 가져온 것으로 참고용만 합니다).

(1) B 세포를 1μM DDAO로 표지하고 4μg/mL CD40L, 100ng/mL BAFF, 1μg/mL 항IgM 또는 2.5μg/mL CpG가 첨가된 완전 RPMI 배지에서 배양합니다.

(2) 3일간 배양한 후 DDAO 희석(그리고 CRISPR 타겟 B 세포에서의 mCherry 발현)을 유세포분석기로 측정합니다.

참고 문헌:

[1] Candas-Green D, Xie B, Huang J, et al. Dual blockade of CD47 and HER2 eliminates radioresistant breast cancer cells[J]. Nature communications, 2020, 11(1): 4591.

[2]Malinova D, Wasim L, Newman R, et al. Endophilin A2 regulates B?cell endocytosis and is required for germinal center and humoral responses[J]. EMBO reports, 2021, 22(9): e51328.