KRN 7000

KRN 7000[(2S,3S.4R)-l-O-(a-D-galactopyranosyl)-2-(N-hexacosanoylamino)-l,3.4-octadecanetriol] ist ein hochwirksames synthetisches Alpha-Galactose-Ceramid, das ursprünglich aus einem Meeresschwamm isoliert wurde. Es wird häufig in der Tumor- und Autoimmunforschung verwendet, weil es CD1d spezifisch auf der Zelloberfläche präsentiert und so NKT-Zellen aktiviert^[1]. KRN7000 ist ein potenter Aktivator antigenpräsentierender Zellen und stimuliert immunregulatorische Zellen wie T-Zellen, natürliche Killer-T-Zellen(NKT) und Makrophagen^[3].

In-vivo-Studien zeigten, dass KRN7000 vo NKT-Zellklonen erkannt wird und Proliferation, Zytokinfreisetzung(IL-4 und IFN-c) sowie zytotoxische Aktivität auslösen kann. KRN7000 verringerte den Anteil der Va24⁺ Vb11⁺T-Zellen, die CD161 exprimierten. Das deutet darauf hin, dass CD161 keine wesentliche Rolle bei der durch KRN7000-aktivierte Va24⁺ Vb11⁺T-Zellen vermittelten Zytotoxizität spielt. Außerdem exprimierten KRN7000-kultivierte Va24⁺Vb11⁺T-Zellen stark CD25 (IL-2Ra). Es ist zu erwarten, dass Zytokine, die auf IL-2R abzielen, die Expansion von Va24⁺ Vb11⁺T-Zellen stark beeinflussen^[2].

In-vivo-Studien zeigten, dass KRN7000 den Beginn einer GVHD bei F1-Mäusen, die mit haploidentischen C57-Splenozyten inokuliert wurden, ohne erkennbare Toxizität verhinderte. Die Behandlung führt zur Aufrechterhaltung eines gesunden Profils und Körpergewichts und beugt auch anderen klinischen Symtomen einer GVHD vor. Die In-vivo-Behandlung mit KRN7000 führte zur Stimulation der NK1.1⁺T-Zell-Subgruppe, die an der Unterdrückunng von Immunreaktionen gegen Autoantigene und der Induktion von Tumorimmunität beteiligt ist. Die In-vivo-Behandlung mit KRN7000 durch Hochregulierug der IL-4-Produktion den Ausbruch einer GVHD verhindern könnte^[3].

KRN 7000 ist ein potentes synthetisches α-Galactosylceramid, das in Verbindung mit dem Antigen-präsentierenden CD1d-Protein NKT-Immunzellen aktiviert. Weil die Zellen eine wichtige Rolle bei der Abwehr bösartiger Tumoren und der Regulation verschiedener Autoimmunerkrankungen spielen, ist KRN 7000 bei vielen Erkrankungen wirksam, einschließlich Krebs, Lupus, Diabetes, Malaria und Tuberkulose.

KRN7000 ist von Natur aus ein extrem hydrophobes Molekül. Deshalb enthalten fast alle Methoden zur Solubilisierung des Materials in überwiegend wässrigen Medien zumindest einen geringen Anteil Detergens. Für Zellkulturen oder andere In-vivo-Modelle wird empfohlen, KRN7000 zunächst in einer 2:1-Mischung aus Chloroform und Methanol zu lösen. Die Lösung soll dann in für den täglichen Gebrauch geeignete Mengen in Glasfläschchen aliquotiert werden. Nach der Aliquotierung kann das Chloroform-/Methanol-Lösungsmittel unter einem Stickstoff- oder Argon-Strom verdampft werden. Wir empfehlen, das Röhrchen während des Vorgangs zu drehen, um eine möglichst dünne KRN7000-Schicht abzuscheiden. Je dünner die KRN7000-Schicht ist, desto einfacher lässt sie sich rekonstituieren. Diese trockenen Aliquots können dann einige Monate oder bis zur Verwendung unter Stickstoff oder Argon bei -20°C gelagert werden. 

Verwenden Sie am Tag des Experiments ein getrocknetes Aliquot und rekonstituieren Sie es mit einer der folgenden Optionen:

PBS mit 0.5% Tween-20. Hinweis: Um das Material aufzulösen, muss es auf 37 °C erwärmt und mindestens zwei Stunden lang in einem Wasserbad beschallt werden. Erhitzen und Beschallen soll unmittelbar vor jedem Gebrauch erfolgen.

5.6% Saccharose mit 0.75% L-Histidin und 0.5% Tween-20. Bei diesem Lösungsmittelsystem ist ein mehrminütiges Erhitzen auf 80°C erforderlich.

100% DMSO (wasserfrei). Es ist wichtig, dass das DMSO vollständig wasserfrei ist. Erhitzen auf 80°C kann erforderlich sein, damit sich KRN7000 vollständig auflöst. Bitte beachten Sie: Die Methode erzeugt zwar eine klare Lösung in DMSO, jedoch ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass KRN7000 ausfällt, sobald DMSO in wässrigem Medium verdünnt wird. Es wird empfohlen, dass das wässrige Medium, in dem die DMSO-Stammlösung verdünnt wird, 10% Serum oder BSA enthält und die DMSO-Stammlösung maximal 1/100 verdünnt wird. Je nach Zusammensetzung des wässrigen Puffers kann es dennoch zu einem Niederschlag kommen, der jedoch durch Erwärmen und wiederholtes Vortexen oder Beschallen in einem Wasserbad-Ultraschallgerät verschwinden soll. Das kann einige Zeit dauern und muss währscheinlich jedes Mal wiederholt werden, wenn Aliquot zur Verwendung aufgetaut wird.

Je nach verwendetem Lösugsmittelsystem unnd Endkonzentration von KRN7000 kann das Ergebnis entweder eine klare Lösung oder eine leicht trübe Suspension sein. Die trüben Suspensionen stellen kein Problem dar und eignen sich gut für die Behandlung von Zellen. Stellen Sie nur sicher, dass sie unmittelbar vor Gebrauch gut gemischt werden.

References:
[1]. Chen Y, et al. KRN7000 Reduces Airway Inflammation via Natural Killer T Cells in Obese Asthmatic Mice. Inflammation. 2021 Oct;44(5):1982-1992.
[2]. Van Der Vliet HJ, et al. Effects of alpha-galactosylceramide (KRN7000), interleukin-12 and interleukin-7 on phenotype and cytokine profile of human Valpha24⁺ Vbeta11⁺ T cells. Immunology. 1999 Dec;98(4):557-63.
[3]. Morecki S, et al. Effect of KRN7000 on induced graft-vs-host disease. Exp Hematol. 2004 Jul;32(7):630-7.