Disuccinimidyl Glutarate (Synonyms: DSG) |
| Catalog No.GC43479 |
Disuccinimidyl Glutarate es un agente de entrecruzamiento bifuncional de N-hidroxisuccinimida insoluble que se utiliza comúnmente para acoplar ligandos radiomarcados a receptores en la superficie celular.
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Cas No.: 79642-50-5
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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Disuccinimidyl Glutarate es un agente de entrecruzamiento bifuncional de N-hidroxisuccinimida insoluble que se utiliza comúnmente para acoplar ligandos radiomarcados a receptores en la superficie celular.
La combinación de Disuccinimidyl Glutarate y el entrecruzamiento con formaldehído es esencial para detectar el enriquecimiento de TET2 en la cromatina. La inclusión del agente de entrecruzamiento de proteínas Disuccinimidyl Glutarate, así como la titulación del anticuerpo y la cromatina de entrada, resultaron en una mejor relación señal-ruido[1]. Cuando se trataron embriones con concentraciones crecientes de DSG (1,0-5 mM) en presencia de un volumen igual de heptano. Después de agitar vigorosamente la suspensión de DSG-embriones durante 1 hora, se añadió formaldehído de manera que la concentración final en la fase acuosa fuera del 4%. Después de una incubación de 15 minutos con formaldehído, los embriones se procesaron incluyendo el paso de entrecruzamiento nuclear con formaldehído. La fijación con DSG-formaldehído es mucho más efectiva para capturar la asociación de Elba con Fab-7 in vivo que solo con formaldehído. La inmunoprecipitación de cromatina con el anticuerpo Elba1 para los embriones tratados con 5,0 mM y 2,5 mM de Disuccinimidyl Glutarate mostró un apreciable enriquecimiento (6-7 veces) de Fab-7 en comparación con el control pre-inmune. La extracción de secuencias de Fab-7 parece ser específica, ya que los 2 loci de control, twe y Sxl, mostraron solo un enriquecimiento de 1-1,5 veces. Aunque no hubo mucha diferencia entre la fijación con 5,0 mM y 2,5 mM de DGS, tener una concentración suficientemente alta de este agente de entrecruzamiento parece ser importante, ya que solo hubo un enriquecimiento limitado con el entrecruzamiento con 1,0 mM de Disuccinimidyl Glutarate[2].
References:
[1]. Rasmussen KD, Helin K. ChIP-Sequencing of TET Proteins. Methods Mol Biol. 2021;2272:251-262. doi: 10.1007/978-1-0716-1294-1_15. PMID: 34009619.
[2]. Aoki T, Wolle D, et,al. Bi-functional cross-linking reagents efficiently capture protein-DNA complexes in Drosophila embryos. Fly (Austin). 2014;8(1):43-51. doi: 10.4161/fly.26805. Epub 2013 Dec 13. PMID: 24135698; PMCID: PMC3974894.
| Crosslinking de embriones para ChIP-Seq [1]: | |
Método de preparación | 1) Después de la descorionación, los embriones se pesaron y transfirieron a un tubo cónico de 50 ml. Si había más de 2 g de embriones, dividimos la muestra en varios tubos. 2) Los ésteres NHS bi-funcionales se disolvieron en DMSO (Dimetilsulfóxido). En el caso del Disuccinimidil Glutarato (DSG), disolvimos 20 mg de polvo de DSG en 108 μl de DMSO para obtener -120 μl de una solución madre de DSG a 500 mM. En el caso del DSP, disolvimos 20 mg de polvo en 85 μl de DMSO para obtener -99 μl de una solución madre de DSP a 500 mM. 3) La mezcla de fijación se preparó añadiendo la solución de éster NHS/DMSO al tampón salino fosfatado (PBS, 150 mM de cloruro de sodio (NaCl) / 10 mM de fosfato de sodio (pH 7.6)). La concentración óptima de los ésteres NHS puede variar según las proteínas objetivo. Las concentraciones máximas de Disuccinimidil Glutarato y DSP en solución acuosa son 5 mM y 2 mM, respectivamente. Para menos de 0.5 g de embrión, prepare 5 ml de solución. Aumente el volumen en 5 ml por cada 0.5 g adicional de embrión. Dado que los ésteres NHS son inestables en soluciones acuosas, esta mezcla de fijación debe prepararse inmediatamente antes de su uso. 4) Vierta la mezcla de fijación en el tubo cónico que contiene los embriones descorionados. Añada un volumen igual de heptano. 5) Agite el tubo vigorosamente durante 1 hora. 6) Agregue 550 μl de formaldehído al 37% por cada 5 ml de fase acuosa para que la concentración final de formaldehído sea del 4%. Agite vigorosamente durante 15 minutos adicionales. 7) Centrifugue el tubo en un rotor de cubo oscilante a 500 g durante un minuto para sedimentar los embriones fijados. Retire la fase de heptano pipeteando. 8) Añada un volumen igual de la solución de parada (PBS con 125 mM de Glicina y 0.1% de Tritón X-100) a la fase acuosa. Mezcle bien, deje reposar durante 2 minutos y luego sedimente los embriones fijados centrifugando a 500 g durante 1 minuto. 9) Retire el sobrenadante pipeteando. Suspenda los embriones en 25 ml de solución de parada y, después de una incubación de 2 minutos, recoja los embriones mediante centrifugación. Gire nuevamente en las mismas condiciones. 10) Retire el sobrenadante y lave los embriones suspendiéndolos en 25 ml de PBST (PBS + 0.05% Tritón X-100) y gire nuevamente en las mismas condiciones. Repita este paso 2 veces. 11) Los embriones fijados pueden procesarse inmediatamente para ChIP o transferirse a un tubo de 1.5 ml, congelarse en nitrógeno líquido y luego almacenarse a -80 ℃ hasta su uso. |
Áreas de aplicación | La fijación con Disuccinimidil Glutarato - formaldehído es mucho más efectiva para capturar la asociación de Elba con Fab-7 in vivo que el formaldehído solo. El ChIP con anticuerpos Elba1 para embriones tratados con DSG a 5.0 mM y 2.5 mM mostró un enriquecimiento apreciable (6-7 veces) de Fab-7 en comparación con el control preinmune. |
| Entrecruzamiento Celular [2]: | |
Método de preparación | 1. Retire un vial nuevo de DSG (disuccinimidil glutarato) del almacenamiento a 4 ℃. Cuando se haya equilibrado a temperatura ambiente, resuspenda el polvo desecado en DMSO para obtener una solución madre de Disuccinimidil Glutarato a 0.25 M. Inmediatamente antes de añadirlo a las células, prepare la solución final de entrecruzamiento con 2 mM de Disuccinimidil Glutarato en PBS frío (por ejemplo, 80 μL de DSG a 0.25 M en 10 mL de PBS). Deseche la solución madre de Disuccinimidil Glutarato a 0.25 M no utilizada, ya que el Disuccinimidil Glutarato reconstituido tiende a hidrolizarse e inactivarse durante el almacenamiento. 2. Resuspenda el pellet celular de cada muestra en 10 mL de solución de entrecruzamiento de DSG a 2 mM recién preparada y fría. Coloque los tubos en un mezclador de rodillos y permita que el entrecruzamiento continúe durante 30 minutos mientras la solución se equilibra a temperatura ambiente. 3. Después de que hayan pasado los primeros 30 minutos, añada formaldehído hasta una concentración final del 1% (por ejemplo, 270 μL de una solución madre al 37% en 10 mL). Incube en un mezclador de rodillos a temperatura ambiente durante 10 minutos adicionales. 4. Inmediatamente después de que hayan pasado los 10 minutos, detenga la reacción de entrecruzamiento añadiendo glicina a 2 M hasta una concentración final de 0.125 M (por ejemplo, 625 μL en 10 mL). Incube en un mezclador de rodillos a temperatura ambiente durante 5 minutos adicionales. 5. Centrifugue las células (300 g/5 min/4 ℃) y lávelas dos veces con PBS frío. Deseche la solución que contiene formaldehído en el contenedor de residuos adecuado. Proceda inmediatamente a la lisis y sonicación. |
Áreas de aplicación | La combinación de entrecruzamiento con Disuccinimidil Glutarato y formaldehído es esencial para detectar el enriquecimiento de TET2 en la cromatina. La inclusión del entrecruzador de proteínas DSG, así como la titulación del anticuerpo y la cromatina de entrada, resultaron en una mejora en la relación señal/ruido. |
Referencias: [1]. Aoki T, Wolle D, Preger-Ben Noon E, Dai Q, Lai EC, Schedl P. Los reactivos de reticulación bi-funcional capturan eficientemente complejos proteína-ADN en embriones de Drosophila. Fly (Austin). 2014;8(1):43-51. doi: 10.4161/fly.26805. Epub 2013 Dec 13. PMID: 24135698; PMCID: PMC3974894. [2]. Rasmussen KD, Helin K. ChIP-Sequencing of TET Proteins. Methods Mol Biol. 2021;2272:251-262. doi: 10.1007/978-1-0716-1294-1_15. PMID: 34009619. | |
| Cas No. | 79642-50-5 | SDF | |
| Sinónimos | DSG | ||
| Canonical SMILES | O=C(CCCC(ON(C(CC1)=O)C1=O)=O)ON2C(CCC2=O)=O | ||
| Formula | C13H14N2O8 | M.Wt | 326.3 |
| Solubility | DMF: 10 mg/ml,DMSO: 20 mg/ml,DMSO:PBS (pH 7.2)(1:5): 0.15 mg/ml | Storage | Store at -20°C |
| General tips | Please select the appropriate solvent to prepare the stock solution according to the
solubility of the product in different solvents; once the solution is prepared, please store it in
separate packages to avoid product failure caused by repeated freezing and thawing.Storage method
and period of the stock solution: When stored at -80°C, please use it within 6 months; when stored
at -20°C, please use it within 1 month. To increase solubility, heat the tube to 37°C and then oscillate in an ultrasonic bath for some time. |
||
| Shipping Condition | Evaluation sample solution: shipped with blue ice. All other sizes available: with RT, or with Blue Ice upon request. | ||
| Prepare stock solution | |||
|
1 mg | 5 mg | 10 mg |
| 1 mM | 3.0647 mL | 15.3233 mL | 30.6466 mL |
| 5 mM | 612.9 μL | 3.0647 mL | 6.1293 mL |
| 10 mM | 306.5 μL | 1.5323 mL | 3.0647 mL |
Step 1: Enter information below (Recommended: An additional animal making an allowance for loss during the experiment)
g
μL
Step 2: Enter the in vivo formulation (This is only the calculator, not formulation. Please contact us first if there is no in vivo formulation at the solubility Section.)
Calculation results:
Working concentration: mg/ml;
Method for preparing DMSO master liquid: mg drug pre-dissolved in μL DMSO ( Master liquid concentration mg/mL, Please contact us first if the concentration exceeds the DMSO solubility of the batch of drug. )
Method for preparing in vivo formulation: Take μL DMSO master liquid, next addμL PEG300, mix and clarify, next addμL Tween 80, mix and clarify, next add μL ddH2O, mix and clarify.
Method for preparing in vivo formulation: Take μL DMSO master liquid, next add μL Corn oil, mix and clarify.
Note: 1. Please make sure the liquid is clear before adding the next solvent.
2. Be sure to add the solvent(s) in order. You must ensure that the solution obtained, in the previous addition, is a clear solution before proceeding to add the next solvent. Physical methods such as vortex, ultrasound or hot water bath can be used to aid dissolving.
3. All of the above co-solvents are available for purchase on the GlpBio website.
Quality Control & SDS
- View current batch:
- Purity: >98.00%
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