Phallacidin

Protocole expérimental pour le marquage fluorescent du cytosquelette d'actine F avec Phallacidin^[1]
Ce protocole est adapté de données de recherches, à titre indicatif seulement. Des ajustements peuvent être nécessaires selon vos besoins expérimentaux.
1.Préparation des réactifs : 
(1)Synthèse de NBD-Phallacidin à partir de phalloidine : On transforme d'abord Phallacidin en amide par réaction avec de l'éthylènediamine. Ce dérivé, qui contient une amine primaire, est ensuite mélangé avec 4-chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD-Cl) dans du méthanol absolu. La réaction donne le dérivé fluorescent NBD-Phalloidine. On peut obtenir une purification partielle par précipitation à l'éther pour séparer la phalloidine marquée et non-marquée.
(2)Solution stock de NBD-Phalloidine : NBD-Phallacidin purifié par chromatographie sur SP-Sephadex est dissous dans un tampon adapté (par exemple, PBS ou HBSS) ou du milieu de culture pour préparer la solution de travail. Pour marquer les cellules fixées : on utilise la préparation partiellement purifiée (environ 20% de NBD-Phalloidine) à une concentration de travail de 0,9-1,7µg/ml. Pour marquer les cellules vivantes : on utilise NBD-Phalliodine purifié aux concentrations de 14-57ng/ml ou 5,7-8,6µg/ml.
(3)Tampons et milieu de culture : Tampon salin phosphate (FBS); Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS); Tampon A à haute teneur en glucose 120mM NaCl, 15mM glucose, 10mM Hepes, 4.4mM NaHCO₃, 3mM KCl, 1mM Na₂PO₄, pH=7.1); Milieu DMEM (milieu Dulbecco modifié d'Eagle) avec 10% de sérum de veau foetal.
2.Fixation et marquage des cellules : 
(1)Fixation des cellules : Les cellules cultivées sur lamelles de verre sont fixées avec 2% de formaldéhyde (dans PBS) pendant 20 minutes à 22°C.
(2)Traitement de perméabilisation : Après deux lavages à PBS, les cellules sont traitées avec de l'acétone pré-refroide (-20°C) pendant 7-10 minutes, puis séchées à l'air.
(3)Marquage : Ajoutez 350µL de PBS ou HBSS contenant 0,3-0,6µg de NBD-Phalloidine sur la lamelle, et laissez marquer pendant 5-30 minutes.
(4)Lavages et observations : Lavez quatre fois avec du tampon à 4°C pour éliminer la toxine  non-liée, puis observez au microscope à fluorescence.
3.Protocole de marquage de cellules animales vivantes : 
(1)Perméabilisation cellulaire : On utilise la méthode à la lysolécithine. Traitez les cellules pendant 2 minutes avec le tampon A à haute teneur en glucose contenant 14-40µg/ml de lysophosphatidylcholine palmitoylique.
(2)Système tampon : Lavez les cellules quatre fois avec le tampon A à haute teneur en glucose pour éliminer la lysolécithine. Ajoutez 350µL de tampon A contenant 5ng de NBD-Phalloidine, laissez marquer 5 minutes à température ambiante. Après marquage, rincez trois fois avec le tampon A, observez dans l'heure qui suit.
(3)Système milieu de culture : Lavez les cellules une fois avec le tampon A à haute teneur en glucose. Ajoutez du milieu DMEM (avec 10% de sérum de veau foetal) contenant 2-3µg de NBD-Phalloidine, laissez marquer 5 minutes dans un incubateur à 37°C. Ensuite, transférez les cellules dans un milieu complet préchauffé pour continuer la culture.
(4)Test de viabilité : le marquage à l'acétate de fluorescéine peut être utilisé pour vérifier l'intégrité de la membrane cellulaire et la viabilité des cellules.
Précautions : 
(1)Cette méthode permet de marquer différentes structures d'actine F connues : fibres de stress, membrane chiffonncé, géodôme cellulaire, actine diffuse associée à la membrane, et câbles d'actine chez les algues. Les noyaux cellulaires ne sont pas marqués.
(2)Pour votre santé et votre sécurité, portez une blouse de laboratoire et des gants jetables pendant la manipulation.

References:
[1] Barak LS, Yocum RR, Nothnagel EA, et al. Fluorescence staining of the actin cytoskeleton in living cells with 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole-phallacidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Feb;77(2):980-4.