Lyso-Tracker Red (solution) (Synonyms: LysoTracker Red DND-99)

Este plan solo proporciona una guía; por favor, modifícalo según tus necesidades específicas.

1. Preparación de la solución de tinción de Lyso-Tracker Red

(1) Preparación de la solución madre: Se recomienda disolver el polvo en DMSO anhidro para preparar una solución madre con una concentración de 1 mM.

Nota: Se aconseja alícuotar la solución madre no utilizada y congelarla a -20°C o -80°C en la oscuridad.

(2) Preparación de la solución de trabajo: Diluir la solución madre con un tampón adecuado (como medio libre de suero o PBS) para obtener una solución de trabajo con una concentración de 50-100 nM.

Notas:

① Ajusta la concentración de la solución de trabajo según la situación real y prepárala según sea necesario.

② Para reducir falsos positivos por un fondo excesivamente alto o sobrecarga, la concentración de los tintes debe ser lo más baja posible.

③ Si las células se incuban en un tampón libre de tinte después de la tinción, se observará atenuación de las señales fluorescentes y vacuolización de las células.

2. Tinción de células en suspensión

(1) Células en suspensión: Centrifuga las células suspendidas a 4°C y 1000g durante 3-5 minutos, desecha el sobrenadante y lava dos veces con PBS durante 5 minutos cada vez.

(2) Células adherentes: Lava dos veces con PBS, añade tripsina para digerir las células y centrifuga a 1000g durante 3-5 minutos después de completar la digestión.

(3) Usa 0.5-1 mL de la solución de trabajo para resuspender aproximadamente 10^6 células e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 5-30 minutos. El tiempo de incubación óptimo varía según las células; explora según las necesidades experimentales específicas.

(4) Después de la incubación, centrifuga a 1000g durante 5 minutos, retira el sobrenadante y añade PBS para lavar 2-3 veces, 5 minutos cada vez.

(5) Resuspende las células en medio de cultivo celular libre de suero o PBS precalentado y observa con un microscopio de fluorescencia o citometría de flujo.

3. Tinción de células adherentes

(1) Cultiva las células adherentes en cubreobjetos estériles.

(2) Retira el cubreobjeto del medio de cultivo, aspira el exceso de medio y coloca el cubreobjeto en un ambiente húmedo.

(3) Añade 100 μL de la solución de trabajo del tinte desde una esquina del cubreobjeto y agita suavemente para cubrir uniformemente todas las células con el tinte.

(4) Incuba a temperatura ambiente en la oscuridad durante 5-30 minutos. El tiempo óptimo de cultivo varía según el tipo de células.

(5) Después de la incubación, desecha la solución de trabajo del tinte y lava el cubreobjeto 2 a 3 veces con solución de cultivo precalentada.

4. Detección de fluorescencia: La máxima absorción/emisión de Lyso-Tracker Red es 577/590 nm.

Notas:

① Un estudio cinético sobre la internalización de Lyso-Tracker mostró que la tasa de captación de esta sonda por células vivas puede completarse en unos pocos segundos. Sin embargo, la sonda exhibe un "efecto de alcalinización" en los lisosomas, y la incubación prolongada puede llevar a un aumento del pH lisosomal. Por lo tanto, incubar las células a 37°C durante 1-5 minutos es un indicador útil del pH.

② Si la tinción no es suficiente, se recomienda aumentar la concentración del tinte o extender el tiempo de tinción para permitir que el tinte se agregue en los lisosomas.

③ Todos los tintes fluorescentes presentan problemas de apagamiento. Intenta evitar la luz tanto como sea posible para ralentizar el apagamiento de la fluorescencia.

④ Para tu seguridad y salud, usa ropa de laboratorio y guantes desechables durante la operación.