Lyso-Tracker Red (solution)

このプランはあくまでもガイドであり、ご自分のニーズに合わせてご調整願います。

1.Lyso-Tracker Red染色溶液の調製

（1）貯蔵液の調製：粉末を溶解するには、無水DMSOを使うことを推奨する。濃度が1mMの貯蔵液を調製する。

注：未使用の貯蔵液を小分けし、暗闇で-20℃または-80℃で冷凍することを推奨する。

（2）作業溶液の調製：適切な緩衝液（例えば無血清またはPBS）で貯蔵液を希釈し、濃度が50-100nMの作業溶液を調製する。

注：

①実際の条件に合わせて、作業液の濃度を調製し、需要に応じて調製してください。

②過度に高いバックグラウンドまたはオーバーロードによる偽の陽性を減らすために、色素の濃度はできるだけ低くするべき。

③細胞が染色後、染色液のない緩衝液で培養されたら、蛍光シグナルの弱化と細胞の空胞化が観察される。

2.細胞懸濁液の染色

（1）懸濁細胞：4℃、1000gで懸濁細胞を3-5分間遠心分離し、上清を除去し、PBSで一回に5分間、計二回洗浄する。

（2）付着細胞：PBSで二回洗浄し、トリプシンを添加し細胞を消化し、消化が終わったあとは1000gで3-5分間遠心分離する。

（3）0.5-1mLの作業溶液を使い、約106の細胞を再懸濁し、室温で暗闇で5-30分間培養する。異なる細胞に対する最適な培養時間は異なるので、特定の実験ニーズに合わせてご自分で研究してください。

（4）培養後、1000gで5分間遠心分離し、上清を除去し、PBSを添加した、1回に5分間、2-3洗浄する。

（5）再棒を事前加温した無血清培地またはPBSで細胞を再懸濁し、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーで観察する。

3.細胞接着の染色

（1）接着細胞を無菌カバーガラスで培養する。

（2）カバーガラスを培地から除去し、余分の培養培地を吸い出し、カバーガラスを湿った環境で置く。

（3）100μLの染料作業溶液をカバーガラスの一角から添加し、ゆっくり振動し、全ての細胞が染料で均一にカバーされるようにする。

（4）暗闇で室温で5-30分間培養する。異なる細胞の最適培養時間はそれぞれ異なる。

（5）培養後、染料作業溶液を廃棄し、事前加温した培養溶液でカバーガラスを2-3回洗浄する。

4.蛍光の検出：Lyso-Tracker Redの最大吸収/発光は577/590nmである。

注：

①Lyso-Trackerの内部移行に関する活動研究は、生細胞によるこのプローブの取り込み率は数秒間で完成されることを示した。しかし、このプローブはリソソーム「アルカリ化効果」を示し、延長した培養は、リソソームpHの増加に導くことができる。よって、細胞を37℃で1-5分間培養することは、有用なpH指示方法である。

②染色が不足であれば、染料濃度を増やす、または染色時間を伸ばすことで、リポソームで染料を集合させることを推奨する。

③蛍光色素はみな消光の問題がある。それを遅らせるためには、できるだけ光から避けてください。

④安全と健康のために、白衣と使い捨ての手袋を装着してください。