Lyso-Tracker Red (solution)

Ce plan n'est qu'un guide, veuillez le modifier pour qu'il réponde à vos besoins spécifiques.

1. Préparer la solution de coloration rouge Lyso-Tracker

(1) Préparer la solution de base : Il est recommandé d'utiliser du DMSO anhydre pour dissoudre la poudre et préparer une solution mère d'une concentration de 1mM.Note : Il est recommandé d'aliquoter la solution stock non utilisée et de la congeler à -20°C ou -80°C à l'abri de la lumière.

(2) Préparation de la solution de travail : Diluer la solution mère avec un tampon approprié (tel que du milieu sans sérum ou du PBS) pour préparer une solution de travail avec une concentration de 50-100nM.

Notes :

① Veuillez ajuster la concentration de la solution de travail en fonction de la situation réelle et la préparer selon les besoins.

② Afin de réduire les faux positifs causés par un bruit de fond trop élevé ou une surcharge, la concentration des colorants doit être aussi faible que possible.

③ Si les cellules sont incubées dans un tampon sans colorant après la coloration, on observera une atténuation des signaux de fluorescence et une vacuolisation des cellules.

2. Coloration des suspensions cellulaires

(1) Cellules en suspension : Centrifuger les cellules en suspension à 4°C et 1000g pendant 3-5 minutes, jeter le surnageant et laver deux fois avec du PBS pendant 5 minutes à chaque fois.

(2) Cellules adhérentes : Laver deux fois avec du PBS, ajouter de la trypsine pour digérer les cellules et centrifuger à 1000g pendant 3-5 minutes après la fin de la digestion.

(3) Utiliser 0,5-1mL de solution de travail pour remettre en suspension environ 106 cellules et incuber à température ambiante dans l'obscurité pendant 5-30 minutes. Le temps d'incubation optimal pour différentes cellules est différent, veuillez l'étudier vous-même en fonction des besoins expérimentaux spécifiques.

(4) Après l'incubation, centrifuger à 1000g pendant 5 minutes, éliminer le surnageant et ajouter du PBS pour laver 2 à 3 fois, 5 minutes à chaque fois.

(5) Remettre les cellules en suspension dans du milieu de culture cellulaire sans sérum préchauffé ou du PBS et observer au microscope à fluorescence ou en cytométrie de flux.

3. Coloration de l'adhésion cellulaire

(1) Cultiver des cellules adhérentes sur des lamelles stériles.

(2) Retirer la lamelle couvre-objet du milieu de culture, aspirer l'excès de milieu de culture et placer la lamelle couvre-objet dans un environnement humide.

(3) Ajouter 100μL de solution de travail de colorant à partir d'un coin de la lamelle couvre-objet et agiter doucement pour couvrir uniformément toutes les cellules avec le colorant.

(4) Incuber à température ambiante dans l'obscurité pendant 5 à 30 minutes. Le temps de culture optimal varie selon les cellules.

(5) Après l'incubation, jeter la solution de travail du colorant et laver la lamelle 2 à 3 fois avec une solution de culture préchauffée.

4. Détection de la fluorescence : La lumière d'absorption/émission maximale de Lyso-Tracker Red est de 577/590 nm.

Notes :

① Une étude cinétique sur l'internalisation de Lyso-Tracker a révélé que le taux d'absorption de cette sonde par les cellules vivantes peut être achevé en quelques secondes. Cependant, la sonde présente un « effet d'alcalinisation » lysosomal, et une incubation prolongée peut entraîner une augmentation du pH lysosomal. Par conséquent, l'incubation de la cellule à 37℃ pendant 1 à 5 minutes est un indicateur de pH utile.

② Si la coloration n'est pas suffisante, il est recommandé d'augmenter la concentration du colorant ou de prolonger le temps de coloration pour permettre au colorant de s'agréger sur les lysosomes.

③ Les colorants fluorescents présentent tous des problèmes d'extinction. Essayez d'éviter la lumière autant que possible afin de ralentir l'extinction de la fluorescence.

④ Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter des vêtements de laboratoire et des gants jetables lors de l'utilisation.