DAPI (hydrochloride) (Synonyms: 4',6Diamidino2phenylindole, FxCycle Violet)

Ce plan n'est qu'un guide; veuillez le modifier pour l'adapter à vos besoins spécifiques.

1.Préparation de la solution de coloration

(1)Préparation de la solution stock du colorant : Dissoudre DAPI dans l'eau bidistillée (ddH₂O) pour obtenir une solution stock à une concentration de 1-10mgml.

Remarques 

1)Ne pas dissoudre la poudre directement dans un tampon; 

2)La solution stock obtenue doit être filtrée et stérilisée à l'aide d'une membrane filtrante de 0,22μm;

3)La solution stock inutilisée doit être aliquotée en doses unitaires et conservée à l'obscurité à -20°C ou -80°C, afin d'éviter les cycles répétés de congélation-décongélation.

(2)Préparation de la solution de travail du colorant : Diluer la solution stock avec de l'eau bidistillée (ddH₂O) ou PBS pour préparer une solution de travail à 0.5-10μgml.

Remarque: veuillez adapter la concentration de la solution de travail selon la situation réelle et la préparer au moment d'utilisation.

2.Coloration de la suspension cellulaire

(1)Cellules en suspension: Centrifuger à 1000g pendant 3-5min à 4°C, éliminer le surnageant, puis laver deux fois avec PBS, 5min à chaque lavage.

(2)Cellules adhérentes: Laver deux fois avec PBS, ajouter de la trypsine pour diréger les cellules, puis centrifuger à 1000g pendant 3-5min une fois la digestion terminée.

(3)Ajouter 1mL de solution de travail de DAPI pour remettre les cellules en suspension, puis incuber à température ambiante à l'obscurité pendant 5-30min. Le temps d'incubation optimal varie selon les types cellulaires; déterminez-le vous-même en fonction des exigences expérimentales spécifiques.

(4)Après incubation, centrifuger à 1000g pendant 5min, éliminer le surnageant, ajouter PBS et laver 2-3 fois, 5min à chaque fois.

(5)Remettre les cellules en suspension dans un milieu de culture sans sérum préchauffé ou PBS. Réaliser l'observation au microscope à fluorescence ou par cytométrie en flux.

3.Coloration de cellules adhérentes

(1)Cultiver les cellules adhérentes sur les lamelles de verre stériles.

(2)Retirer la lamelle du milieu de culture, aspirer l'excès de milieu et placer la lamelle dans une atmosphère humide.

(3)Ajouter 100μL de solution de travail du colorant depuis un coin de la lamelle, puis agiter doucement pour recouvrir uniformément l'ensemble des cellules.

(4)Incuber à température ambiante à l'obscurité pendant 3-5 minute. Le temps d'incubation optimal varie selon les types cellulaires; déterminez-le vous-même en fonction des exigences expérimentales spécifiques.

(5)A la fin de l'incubation, éliminer la solution de travail du colorant et laver la lamelle 2 à 3 fois avec le milieu de culture préchauffé.

4.Détection microscopique: Les longueurs d'onde maximales d'excitation et d'émission de DAPI sont respectivement 364nm et 454nm.

Précautions 

1)DAPI convient au marquage de cellules ou de tissus fixés, généralement après d'autres colorations;

2)Pour ralentir le phénomène de photoblanchiment, il est possible d'utiliser un milieu de montage anti-photoblanchiment; 

3)Tous les colorants fluorescents sont sujets au photoblanchiment. Evitez l'exposition à la lumière pour limiter ce phénomène.

4)DAPI est irritant pour l'organisme humain. Pour votre sécurité et votre santé, portez une blouse de laboratoire et des gants jetabes lors des opérations.