One-step TUNEL Apoptosis Detection Kit (Green, FITC)

Iご自分で用意する必要のある試薬

1.細胞サンプルと冷凍切片：

新鮮な4%のパラホルムアルデヒド（PBSに）、0.2% Triton X-100（PBSに）を調製する。これらの試薬は、実験の1-2日前に調製し、4℃に保存するべき。

2.パラフィン切片：

キシレン、無水エタノール

3.その他の試薬：

PBS, ddH₂O, Antifade Mounting Medium with DAPI (Cat.No. GC26283)

II実験のプロトコール

　1.細胞スライドのサンプル

1.1.サンプルの事前処理

1.1.1.適切なサイズのウェルプレートで、TCで処理された細胞カバーガラスで接着細胞を培養する。アポトーシスの誘導後、PBSでカバーガラスを二回洗う。

1.1.2.過剰の4%のパラホルムアルデヒドを添加し、カバーガラスを完全に浸し、4℃で25分間置き、よって細胞を固定する。

1.1.3.PBS溶液で、5分間ずつ、室温で2-3回洗浄する。

      1.1.4.過剰の0.2%のTriton X-100を添加し、室温で5分間透過させる。

　 注：透過にはTriton X-100を優先に使うことを推奨する。Proteinase Kも使える。1：100の比例で、PBSで2mg/mLのProteinase Kを希釈し、最終濃度を20μg/mLにする。各サンプルに100μLの希釈Proteinase K溶液を添加し、よって溶液がサンプル全体にカバーし、そして室温で5分間培養する（培養時間は検討必要）。最長の透過時間は15分を超えてはならない。

　 1.1.5.PBS溶液で2-3回洗浄し、一回に5分間。

1.2.（随意のステップ）陽性対照物

1.2.1.湿ったカセットを準備し、一層の水を底に注ぎ、水の上に平らかに清潔なラップを置く。

1.2.2.後続する使用のために、1：10の比例でddH₂Oを使い、10×DNase I Bufferを1×DNase I Bufferに希釈する。

1.2.3.100μLの1×DNase I Bufferを湿ったカセットのラップに添加する。ウェルプレートからカバーガラスを除去し、細胞を下に向いて置き、1×DNase I Bufferをカバーする。室温で5分間平衡させる。

1.2.4.DNase I (2000U/mL)を1×DNase I Bufferを希釈し、最終濃度を20U/mLにする。

1.2.5.湿ったカセットのラップに50μLの20U/mL DNase I溶液を添加する。

1.2.6.カバーガラスを取り出し、過剰の液体をゆっくり吸収し、細胞を下に向いて、20U/mLのDNase Iに置く。37℃で10分間培養する。

1.2.7.カバーガラスを取り出し、細胞の一面を上に、清潔なウェルプレートに置き、過剰なPBSで一回に5分間、3回洗浄する。

注：陽性の対照物には、単独の染色ジャーまたはウェルプレートを使わなければならない。陽性対照物における残分のDNaseIは、実験グループで偽陽性のシグナルを起こす可能性がある。

1.3.マーキングと検出

1.3.1.遮光の湿ったカセットを準備し、一層の水を底に注ぎ、水の上に平らかに清潔なラップを置く。

1.3.2. 1：5の比例で、ddH₂Oを使い、5×Equilibration Bufferを1×Equilibration Bufferに希釈する。

1.3.3.100μLの1×DNase I Bufferを湿ったカセットのラップに添加する。ウェルプレートからカバーガラスを除去し、細胞を下に向いて置き、1×DNase I Bufferをカバーする。室温で5-10分間平衡させる。

　1.3.4.平衡の間、下記のテーブルに従い、氷浴と光から避けた条件下で、TdT標識溶液を調製する。

1.3.5.平衡の後、50μLの標識溶液を清潔なラップに添加する。カバーガラスを取り出し、過剰の液体をゆっくり吸収し、細胞の一面を下に、対応する標識溶液に置き、光から遠ざける。

注：標識溶液の体積：面積が5cm²以下の反応については、50μLを使う。TdT標識溶液の総体積を測定するには、50μL×実験と陽性対照反応の数で測定する。より大きい面積のサンプルについては、比例的に試薬の体積を増やすことができる。

1.3.6.湿ったカセットの蓋をしっかり閉じ、光から遠ざけて、カバーガラスが乾燥になるのを防止し、37℃で60分間培養する。

1.3.7.カバーガラスを取り出し、過剰の液体をゆっくり除去し、一回に5分間、新鮮なPBS溶液で二回室温で洗浄する。

注：バックグラウンドがあまりにも高い場合、それを減らすためには、PBSで洗浄した後、0.1%のTriton X-100と5mg/mLのBSA を含むPBSで5分間ずつ3回洗浄し、よって遊離の未反応マーカーを除去する。

1.3.8.Antifade Mounting Medium with DAPI (Cat. No. GC26283)をスライドに一滴添加する。

1.3.9.カバーガラスを除去し、過剰の液体をゆっくり除去し、スライドのAntifade Mounting Medium with DAPIにカバーガラスを置き、密封する。

1.3.10蛍光顕微鏡でサンプルを速やかに分析し、励起/発光波長が492/517nmで緑色の蛍光を観察する；または、356/451nmの励起/発光波長でDAPIの青色の蛍光を観察する。

2.細胞塗抹サンプル

2.1.サンプルの事前処理

2.1.1. 2×10⁶細胞/mLの濃度でPBSで細胞を懸濁する。50-100μLの細胞懸濁をポリリジンコーティングスライドにピペットで滴下し、乾かせる。

2.1.2.塗抹標本を、4%のパラホルムアルデヒドを含む染色ジャーに浸し、4℃で25分間培養し、細胞を固定する。

2.1.3.PBS溶液で5分間ずつ室温で2-3回洗浄する。

2.1.4.0.2%のTriton X-100溶液にスライドを浸し、室温で5分間培養し、細胞を浸透させる。

注：浸透にはTriton X-100を優先に使うことを推奨する。Proteinase Kも使える。1：100の比例で、PBSで2mg/mLのProteinase Kを希釈し、最終濃度を20μg/mLにさせる。各サンプルに100μLの希釈Proteinase K溶液を添加し、よって溶液がサンプル全体にカバーし、そして室温で5分間培養する（培養時間の最適化は不可欠）。

2.1.5.PBS溶液で1回5分間、室温で2-3回洗浄する。

2.1.6.注意を払いながら、フィルターペーパーを使い、スライドにあるサンプル付近の液体を吸収する。湿度を保つには、処理済みのサンプルを湿ったカセットに置くべき。

2.2.（随意のステップ）陽性対照物

2.2.1.遮光の湿ったカセットを準備し、湿ったティッシュを底に置き、全てのスライドを湿ったカセットに移す。

2.2.2.後続する使用の為に、1：10の比例で、ddH₂Oを使い10×DNase I Bufferを1×DNase I Bufferに希釈する。

2.2.3.浸透したサンプルに100μLの1×DNase I Bufferを添加し、室温で5分間平衡させる。

2.2.4. 1×DNase I BufferでDNase I (2000U/mL)を希釈し、最終濃度を20U/mLにさせる。

2.2.5.フィルターペーパーを使い、カバーグラスの過剰液体をゆっくり吸収する。100μLの20U/mL DNase I溶液を各陽性対照サンプルに添加する。

2.2.6.37℃で10分間培養する。

2.2.7.スライドの過剰液体をゆっくり吸収し、PBSで一回に5分間、3回洗浄する。

注：陽性の対照物には、単独の染色ジャーまたはウェルプレートを使わなければならない。陽性対照物における残分のDNaseIは、実験グループで偽陽性のシグナルを起こす可能性がある。

2.3.標識と検出

2.3.1.湿ったティシューを湿ったカセットの底に置き、全てのスライドを湿ったカセットに移す。

2.3.2. 1:5の比例でddH₂Oで5×Equilibration Bufferを1×Equilibration Bufferに希釈する。

2.3.3.湿ったカセットの中のサンプルに100μLの1×Equilibration Bufferを添加し、室温で5-10分間平衡させる。

2.3.4.平衡の間、下記のテーブルに従い、氷浴と光から避けた条件下で、TdT標識溶液を調製する。

2.3.5.平衡の後、過剰の液体をゆっくり除去する。50μLの標識溶液をサンプルに添加し、注意を払って光から遠ざける。

注：標識溶液の体積：面積が5cm²以下の反応については、50μLを使う。TdT標識溶液の総体積を測定するには、50μL×実験と陽性対照反応の数で測定する。より大きい面積のサンプルについては、比例的に試薬の体積を増やすことができる。

2.3.6 湿ったカセットの蓋をしっかり閉じ、光から遠ざけて、カバーガラスが乾燥になるのを防止し、37℃で60分間培養する。

2.3.7.カバーガラスを取り出し、過剰の液体をゆっくり除去し、一回に5分間、新鮮なPBS溶液で二回室温で洗浄する。

注：バックグラウンドがあまりにも高い場合、それを減らすためには、PBSで洗浄した後、0.1%のTriton X-100と5mg/mLのBSA を含むPBSで5分間ずつ3回洗浄し、よって遊離の未反応マーカーを除去する。

2.3.8.Antifade Mounting Medium with DAPI (Cat. No. GC26283)をスライドに一滴添加する。

1.3.9.カバーガラスを除去し、過剰の液体をゆっくり除去し、スライドのAntifade Mounting Medium with DAPIにカバーガラスを置き、密封する。

1.3.10蛍光顕微鏡でサンプルを速やかに分析し、励起/発光波長が492/517nmで緑色の蛍光を観察する；または、356/451nmの励起/発光波長でDAPIの青色の蛍光を観察する。

3.パラフィン包埋組織切片

3.1.サンプルの事前処理

3.1.1.キシレンに切片を室温で浸し、毎回5-10分間、2回プロセスを実行し、パラフィンを徹底的に除去する。

注：キシレンは有毒で、揮発しやすい、このステップは独立の実験室またはドラフトチャンバーで行ってください。低温はキレシンの脱蝋を影響する可能性があるので、室温が20℃以下の時、キレシン脱蝋の時間は20分間に延ばすことができる。

3.1.2.切片を無水エタノールに浸し、室温で、一回5分間、2回浸して洗う。

3.1.3.切片を90%、80%と70%のエタノールに室温で、それぞれ3分間浸す。

3.1.4.PBSで切片を浸して洗い、注意を払いながらフィルターペーパーで、スライドの上のサンプル付近の過剰液体を吸収する。

3.1.5. 1:100の比率のPBSで、濃度が2mg/mLのProteinase K溶液を希釈し、最終濃度を20μg/mLにさせる。100μLの希釈Proteinase K溶液を各サンプルに添加し、全てのサンプルエリアをカバーし、室温で15-30分間培養する。

注：反応時間は、組織のタイプまたは種によって異なる可能性がある。Proteinase Kへの過度暴露は、後続する手続きでサンプルがスライドから剥がれる可能性があり、浸透が不足であれば、標識効率が低いことに導く可能性がある。反応条件を最適化するためには、事前実験を推奨する。

3.1.6.PBS溶液でサンプルを浸し、1回に5分間、計三回洗浄する。過剰の液体をゆっくり除去し、スライドのサンプル付近の液体を、フィルターペーパーで注意を払いながら吸収する。処理されたサンプルを湿ったカセットで保湿する。

注：このステップでは、Proteinase Kを徹底的に除去せねばならない。残留の酵素は、後続する標識反応を著しく干渉する可能性がある。

3.2.陽性対照物（随意のステップ）

2.2に書かれている、陽性対照物の手続きを参照。

3.3.標識と検出

3.3.に書かれている、細胞塗抹サンプルの標識と検出ステップを参照。

4.冷凍組織の切片

4.1.サンプルの事前処理

4.1.1.冷凍の組織切片を長い棚に置き、室温で20分間乾燥させる。

4.1.2.切片を4%のパラホルムアルデヒド溶液に浸し、30分間室温で固定する。

4.1.3.フィルターペーパーでスライドの過剰溶液をゆっくり吸収する。

4.1.4.PBSで切片を浸し、1回5分間、二回洗浄する。フィルターペーパーでスライドの過剰溶液をゆっくり吸収する。

4.1.5. 100μLの0.2% Triton X-100を添加し、各サンプルの全エリアをカバーする。室温で15-30分間浸透する。浸透が不十分な場合は、1:100の比例で、PBSで濃度が2mg/mLのProteinase K溶液を希釈し、最終濃度を20μg/mlにする。各サンプルに100μLの希釈Proteinase K溶液を添加し、溶液がサンプルの全エリアをカバーさせ、室温で10-30分間培養する。

注：培養時間は、組織のタイプまたは種類によって異なる可能性がある。Proteinase Kへの過度暴露は、後続する手続きでサンプルがスライドから剥がれる可能性があり、浸透が不足であれば、標識効率が低いことに導く可能性がある。反応条件を最適化するためには、事前実験を推奨する。

4.1.6.PBS溶液でサンプルを浸し、1回5分間、計3回洗浄する。過剰の溶液をゆっくり除去し、フィルターペーパーでスライドの上のサンプル付近の液体を注意を払いながら吸収する。処理されたサンプルを湿ったカセットで保湿させる。

注：このステップでは、Proteinase Kを徹底的に除去せねばならない。残留の酵素は、後続する標識反応を著しく干渉する可能性がある。

III注意事項

1. 5×Equilibration緩衝液には界面活性剤が含まれているため、細胞塗抹/切片サンプルに添加された時には拡散して排出する。実験の前、PAP Penで染色の部位を丸で囲むことを推奨する。

2.実験の前に、室温で5×Equilibration Bufferを溶解する。融解後には5×Equilibration Bufferの結晶化が起きる可能性があり、これは正常な現象である。使用前に徹底的にボルテックスする。

3.FITC-12-dUTP MixとTdT Enzymeの両方とも、ボルテックスと繰り返した冷凍解凍循環を避けるべきである。使用の前に、FITC-12-dUTP Mixを氷に置き、完全に溶解させる。溶解されたら直ちに、遠心分離し、ペピッティングして混合する。TdT Enzymeは温度に敏感なので、-20℃以下で厳重に保存し、使用の前に取り出し、使用の直後に元に戻す。

4.標識溶液と陽性対照物DNase I溶液を準備する時は、ボルテックスしないことを推奨する。

5.実験中は、サンプルを保湿してください。乾燥は、実験の失敗を招来する恐れがある。

6.このキットは、研究目的のみに使われる。

7.安全事項に注意を払い、実験室試薬操作の手続きに従ってください。

8.このマニュアルで推奨されている条件は汎用的なものである。利用者は、異なるサンプルの種類と事前実験の結果に合わせて、サンプル処理時間、試薬濃度とその他の条件を最適化し、最適の実験条件を選ぶことができる。

IV 異常時の処置