Phosbind Biotin BTL-104 |
カタログ番号GK10006
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Phosbind Biotin BTL-104は、ZnCl2を含有するモノビオチン化のPhosbind誘導体であり、リン酸化ペプチドと精製リン酸化タンパク質の検出に使われる。Phosbindは、リン酸イオンに特異的に結合できる機能分子である。
Products are for research use only. Not for human use. We do not sell to patients.
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
Phosbindは新型のリン酸結合タグと機能分子であり、中性pH（生理pH）の下では、リン酸を特異的に結合できる。Phosbindは二環式金属錯体(1,3-bis[bis(pyridin-2-ylmethyl) amino]propan-2-olato dizinc(II) complex)であり、選択性のリン酸結合タグであり、中性pHの水溶液では、Zn2+の存在する場合で、そのフェニルリン酸ジアニオン(PH-OPO32-)に対するKd値は25 nMである。よって、Phosbind誘導体を使う様々なホスホプロテオーム研究法が開発された。そこで、我々は新しいPhosbindの応用法を紹介する。ビオチン化のPhosbind亜鉛(II)複合体を使い、電子ブロットPVDF膜における全てのリン酸化タンパク質の化学発光検出である。
Phosbind Biotinは、PVDF膜におけるリン酸化タンパク質の研究のための感受性の高い方法を提供し、この方法は、ストレプトマイシン共役のhorseradish過酸化酵素(HRP)と化学発光検出試薬が必要である。
References:
[1] Fanqiang Meng, Fengxia Lu, et al. "Acetate and auto‐inducing peptide are independent triggers of quorum sensing inLactobacillus plantarum." Mol Microbiol. 2021 Jul;116(1):298-310. PMID: 33660340
[2] Haijing Guo, Jen-Hsuan Wei, et al. "TPX2 activation by GM130 controls astral microtubule formation and spindle orientation." bioRxiv. March 17, 2020.
このプランはガイドのみを提供し、ご自分のニーズに合わせてご調整願います。
1.Phosbind Biotin BTL-104溶液の調製
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Sol. A ：トリス緩衝生理食塩水 |
トリス緩衝生理食塩水(10xTBS, 1 L, pH 7.5) Tris (0.10 mol/L) -----------------------------------------------12.1 g NaCl (1.0 mol/L) -----------------------------------------------58.4 g 蒸留水-----------------------------------------------------0.9 L pHを7.5に調整するための2 mol/LのHCl水溶液--------------適量 1Lの溶液の調製に使われる蒸留水-----------適量 |
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Sol. B: Tween 20溶液 |
10% (v/v) Tween 20溶液(50 mL) Tween 20 ----------------------------------------------------------5 mL 蒸留水 ---------------------------------------------------45 mL |
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Sol. C: TBS-T |
1xTBS-T (1 L) 溶液A ----------------------------------------------------------100 mL 溶液B -----------------------------------------------------------10 mL 蒸留水 ------------------------------------------------890 mL |
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Sol. D: Phosbind Biotin BTL-104メタノール溶液 |
Phosbind Biotin BTL-104メタノール溶液 Phosbind Biotin BTL-104 (MW: 767)--------------------------10 mg メタノール----------------------------------------------0.13 mL 【保存】4℃、暗所で保存した。 |
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Sol. E: Phosbind Biotin BTL-104溶液 |
Phosbind Biotin BTL-104溶液(5 mmol/L) 溶液D-------------------------------------------------------0.13 mL 蒸留水-------------------------------------------------------2.47 mL 【保存】4℃、暗所で保存した。 |
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Sol. F: ZnCl2水溶液
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10 mmol/LのZnCl2水溶液 (50 mL) ZnCl2 (FW. 136.3)---------------------------------- 68.15 mg 蒸留水 --------------------------------------------------50 mL |
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Sol. G: ストレプトアビジン共役西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液 |
ストレプトアビジン共役西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液 |
2.Phosbind Biotin-Streptavidin-共役HRPの調製
1)下記の溶液を混合した後、得られた溶液（溶液H）を室温で30分間静置した。
溶液C (1xTBS-T) ------------------------------------------------------------------459 μL
溶液E (Phosbind Biotin BTL-104溶液) *------------------------------------------ 2 ~ 20 μL
溶液F (10 mmol/L ZnCl2)------------------------------------------------ 2 ~ 20 μL
溶液G (Streptavidin共役のHorseradish Peroxidase) --------------------- 1 μL
2)溶液Hを遠心濾過装置カップ（NMWL = 30,000, NanosepTM 30K）に添加した。付属のカップで密封する。
3)室温で、20分間遠心分離(14,000 x g)し、余分のPhosbind Biotin BTL-104を除去する。
4)カップの中の残りの溶液(<10 μL)を30 mLの溶液C(1xTBS-T)で希釈し、溶液Phosbind Biotin-SH（Zn2+-Phosbind Biotin-結合のStreptavidin共役のHRP溶液**）を獲得した。
*: [Phosbind Biotin BTL-104] >> [Streptavidin共役HRP]
: 溶液Phosbind Biotin-SHの中のPhosbind Biotin結合Streptavidin-共役HRP は、4℃で30日間安定する。
3.Phosbind Biotin結合Streptavidin-共役HRPによるプローブ
1)Tupperwareで、タンパク質ブロットのPVDF膜を、溶液C(1xTBS-T)で浸した。この手続きで、プラスティックの手袋を使用する。膜を少なくとも1時間振盪する。膜がTupperwareに付着しないことを確認する。膜を乾かさないように注意を払うべき。
2)プラスティックバッグで、膜を溶液Phosbind Biotin-SH (ca. 1 mL/5 cm2)で培養した。バッグを30分間ゆっくり振盪した。
3)膜をバッグから取り出し、室温で、Tupperwareで溶液C（ca. 10 mL/5 cm2）で毎回5分間、二回洗浄した（Tupperwareをゆっくり揺らした）。膜がTupperwareに付着しないことを確認する。膜を乾かさないように注意を払うべき。
4)X線フィルムまたは画像分析器を使い、適切な量の化学発光試薬（例えばUltra High Sensitivity ECL Kit GK10008など）で化学発光を観察した。
4.タンパク質ブロットのPVDF膜の再度プローブ
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Sol. K: Tris-HCl緩衝液 |
0.5 mol/LのTris-HCl緩衝液 (1 L, pH 6.8) Tris ----------------------------------------------------------- 60.6 g 蒸留水--------------------------------------------------0.8 L pHを6.8に調整するための6 mol/LのHCl溶液----------適量 1 Lの溶液の調製に使われた蒸留水-------適量 |
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Sol. L: SDS溶液 |
10% (w/v)のSDS水溶液(1 L) SDS ----------------------------------------------------------100 g 1 Lの溶液の調製に使われた蒸留水-------適量 |
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Sol. M: ストリッピングバッファー |
ストリッピングバッファー (1 L) 溶液K --------------------------------------------------------125 mL 溶液L -------------------------------------------------------200 mL 2-メルカプトエタノール ----------------------------------------- 7 mL 蒸留水---------------------------------------------668 mL |
1)Zn2+-Phosbind BiotinとStreptavidin-共役のHRPでプローブされたタンパク質ブロットPVDF膜をTupperwareで、溶液C(1xTBS-T, 25 mL/5 cm2)で浸した。
膜を少なくとも1時間振盪した。膜を乾かさないように注意を払うべきである。膜が乾いた場合は、このストリッピングの前に、膜をメタノールで浸すべきである。
2)Tupperwareで、膜を溶液M（ストリッピングバッファー、25 mL/5 cm2）で浸した。室温で、膜を20分間ゆっくり振盪する。加熱する必要はない。膜がTupperwareに付着しないことを確認する。
3)Tupperwareで、膜を溶液C(1xTBS-T, 25 mL/5 cm2)で浸した。室温で、膜を1時間ゆっくり振盪した。3回洗浄する。膜がTupperwareに付着しないことを確保し、膜を乾かさないように注意を払うべきである。
4)膜を適切な量のタンパク質で遮断し、その後は適切な抗生物質で再度プローブした。化学発光分析を実行した。
5.異常時の処置
1)溶液Eの中のPhosbind Biotin（20μL）は、溶液Gの中のStreptavidin-共役Horseradish Peroxidase（1μL）と比べて、大いに過剰している。より少ない量のPhosbind Biotin (e.g., 2 μL 溶液E)と溶液G（1μL）を使い、ほぼ同じ結果を得た。使用者は、溶液Dの量を調整し、よって希望の感受性を得るか、または費用を節約する。溶液Eの量が減った場合は、亜鉛(II)溶液（溶液F）の量を変える必要はない。
2)膜が溶液Cで徹底的には浸されない場合は、背景シグナルは高くなり、斑点状になる。更に、タンパク質シグナルを観察できない場合がある（耐えば、右側の図の白い斑点）。膜が溶液Cを排斥しないように確保するべきである。
3) PVDF膜には、Phosbind Biotin法の使用を強く推薦する。
6.FAQ
1)Q：感受性レベルはどうなのか？
A：ナノグラムのレベルにある。ImmunoStar LDなどの高発光試薬を使用するべきである。
2)Q：この製品以外の試薬が必要なのか？
A：Streptavidin-共役HRP溶液を調製する必要がある。
3)Q：Phosbind Biotin BTL-104は何回使用できるか？
A：使用の頻度により異なる。下記の内容を参考にしてください。BTL-104: 130～1300回
4)Q：リン酸化されたタンパク質を評価できるか？
A：バンドの密度により、半定量分析を行える。
5)Q：結合リン酸基の数を測定できるか？
A：いいえ、できない。
6)Q：Phosbind Biotin BTL-104の抗体を除去できるか？
A：はい、できる。62.5 mMのTris-HCl (pH 6.8)、2% (w/v) of SDSと0.1 Mの2-mercaptoethanolを含有する溶液で混合し、混合物を15分間振盪する。その後、混合物を1×TBS-Tで毎回10分間、計3回洗浄する。
7)Q：どのような膜がおすすめか？
A：PVDF膜を推奨する。
8)Q：Phosbind Biotin BTL-104の使用時に密閉は必要か？
A：いいえ、必要ない。密閉すれば、感受性は落ちてしまう。
| Components | Formula | M.Wt | Solubility |
| Phosbind Biotin BTL-104 | C40H50N10O4S | 766.95 | DMSO: >32.3 mg/mL |
| ZnCl2 | ZnCl2 | 136.3 | Water: >2 mg/mL |
| Applications |
● No radiation.
● No need for PVDF membrane sealing treatment. ● Phosbind The specific binding of is independent of the type and sequence of amino acids. ● Applicable for subsequent work such as immunoblotting and mass spectrometry analysis. ● Phosbind The BTL mother liquor can be stably stored for at least 6 months. ● The experimental process is similar to using HRP labeled antibodies. |
| Shipping | Blue ice transportation or according to your needs. |
| Storage Conditions | 2-8 ℃, stable for up to 12 months. |
| Usage | For research use only! Not for use on humans. |
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