PKH 67 Cell Membrane Labeling Kit

1.染色溶液の調製：

(1) 一回目の使用の前に、冷蔵庫から試薬を取り出し、数分間放置して室温に戻す。溶液A(PKH67貯蔵液)のチューブをゆっくり遠心分離し、試薬をチューブの底で集中させる。

注：溶液Aは簡単に分解できる。一次使用量に合わせて溶液Aを小分けし、繰り返された冷凍と解凍を避けるために、光から遠ざけて、-20℃または-80℃で保存することを推奨する。

(2) テストされる細胞サンプルの数に合わせ、溶液Aを溶液Bで10回希釈し、その後は適切な溶液（無血清培地、HBSSまたはPBS）で25倍希釈し、使用できる染色作業溶液を調製する。

注：色々な細胞と実験システムを参照して最適な作業溶液の濃度を調整することを推奨する。一般的なスキームは、使用するために溶液Aを250倍希釈することである。一部の細胞については、適切に濃度を調整する必要があるかもしれない。

2.細胞の染色

(1) 1.5mlの円錐底ポリプロピレン遠心管で単一細胞懸濁液を調製し、無血清培養基で細胞を一回洗浄する。

(2) 400×gで細胞を5分間遠心分離し、緩い細胞ペレットを得る。

(3) 上清をゆっくり吸引し、細胞を吸引しないように注意を払うべきである。

(4) 約100μLの染色作業溶液を使い細胞を完全に再懸濁する。作業溶液における細胞の推奨濃度は約10⁷/mlである。

(5) 2-8℃で15-30分間培養する。最適の培養時間は異なる細胞で異なる。

注：

① 37℃で5分間培養し、その後4℃に移して15分培養することを推奨する。低温の培養は細胞による染料のエンドサイトーシスを減らし、染料が細胞膜をマークするよう手助けをし、染料が細胞質小胞に局在する可能性を低減する。

② 染料がサンプルを完全に標識するように、染色の過程に細胞を2-3回再懸濁することを推奨する。

(6) 20-25℃で、400×gで細胞を10分間遠心分離し、上清をゆっくり吸引除去し、その後PBSまたは無血清培地で細胞を2回洗浄し、未結合の染料が完全に除去されたことを確認する。

(7) フローサイトメトリーで標識された細胞を検出する。Ex/Em=490/502nm

注：

1.蛍光染料は全て消光の問題があるので、それを遅らせるためには実験中光をできる限り避けるようにしてください。

2.安全と健康の為に、実験中は白衣と使い捨ての手袋を装着してください。