TRIzol NC Reagent

自己提供の試薬

クロロホルム、イソプロパノール、75%のエタノール（RNase-フリーのddH₂Oで調製）、RNaseフリーH₂O

Ⅰ 実験前の準備

RNAの調製で最も肝心なことは、細胞におけるRNA降格酵素を阻害し、使用した設備と試薬におけるRNA降格酵素の汚染を避けることである。よって、実験を行う時は必ず下記の手続きを従わなければならない：使い捨ての綺麗な手袋とマスクを着用すること；RNA実験のためには特別な実験台を使うこと；実験中には会話しないことなどである。上記の手続きにより、RNA降格酵素が実験者の汗と唾液を汚染することを防ぐことができる。

注意事項：

1．できるだけ使い捨ての無酵素無菌プラスチック製の消耗品を使用してください。ガラス製品を使用する場合は、使用前に0.1%のDEPC水溶液で37℃で12時間処理して、残留のDEPCには120℃で30分間オートクレーブ処理するべきである。

2．RNA実験に使われる試薬は、乾燥の熱（180℃、60分間）で殺菌するか、または上記の方法でDEPC水処理または殺菌の後、グラス容器で殺菌しなければならない（RNA実験用の使い捨てプラスチック容器も使える）。使用する滅菌水は0.1％のDEPCで処理し、オートクレーブ処理しなければならない。

3. RNA実験用の試薬と殺菌水は、混合後の交差汚染を避けるために調製すべきである。

4.この製品は科学研究にのみ使われることができる。臨床診断や他の条理的ではない目的に使わないでください。

5.この製品にはフェノールが含まれていて、フェノールは毒性と腐食性を持っている。使用時には、保護性の服、手袋、アイマスク、フェイスマスクなどの保護装置を装着するべきである。製品が目に入った場合は、ただちに十分の水で洗い流し、病院で治療を受けるべきである。皮膚と接触した場合は、ただちに大量の洗剤と水で洗い流し、それでも体調が悪ければ、病院で治療を受けてください。

Ⅱ 実験のプロセス

1．サンプルの処理

1.1動物/植物の組織

1.1.1新鮮な組織を液体窒素で冷凍し、その後速やかに液体窒素で事前に冷却した乳鉢に移す。乳棒で細かく砕き、同時に液体窒素を添加して、サンプルを粉末状になるまで徹底的に砕く。

　注：砕きが足りない場合は、RNAの産出と質を損害する可能性もある。

1.1.2粉末状のサンプルを遠心分離管に転移し、50mgの組織ごとに500μLのTRIzol NC試薬を添加し、ボルテックスして、サンプルを完全に溶解する。室温で5分間培養する。

注：最多50mgの動物/植物組織は500μLのTRIzol NC試薬に溶解されることができる。多すぎるサンプルは、不完全な溶解に導き、製品の精度を損害する可能性がある。肝臓、脾臓、腎臓とその他の組織はDNA/RNAで数多く存在して、過度なサンプルのインプットは残留gDNAまたは低量のRNAに導く。

注：液体窒素における低温粉砕が実行不可能であれば、新鮮組織をできるだけ切り刻み、TRIzol NC試薬に浸潤して、組織の断片が完全溶解されるまで高速の電子破砕機で破砕する。

1.1.3 （最適）室温で11200rpm (12,000xg)で5分間遠心分離する。注意を払って上清を新しい1.5mlの遠心分離管に移し、沈殿物を吸引しないでください。

　注：サンプルに大量のタンパク質、脂肪、多糖体または筋肉繊維、塊茎などが含まれている場合は、溶解不能の物質は遠心分離で除去されることができる。遠心分離から得られた沈殿物には、細胞膜、多糖体、高分子量のDNAを含んでいる。同時に、RNAは上清に残るままである。高い脂肪含有量の組織サンプルを抽出するとき、上層に大量の油が含まれているのなら、除去するべきである。上清を移したあとは、次のステップを実行する。

1.2懸濁細胞

1.2.1 遠心分離で細胞を採集し、上清を徹底的に廃棄し、1×10⁶ - 1×10⁷の細胞ごとに500μLのTRIzol NC試薬を添加する。

1.2.2細胞が完全に溶解されるまで、ボルテックスまたはピペットで上下に動かして、室温で5分間培養する。

　注：冷凍細胞については、不完全な溶解を避ける為に、TRIzol NC試薬は直ちにボルテックスするべきである。

1.3接着細胞

1.3.1培地を廃棄し、1×PBSで一回洗浄する。

1.3.2　6ウェルの培養皿の各ウェルに、または3.5cmの直径皿（培養面積は約10cm²）に500μLのTRIzol NC試薬を添加して、TRIzol NC試薬が細胞層を完全にカバーするようにして、その後、ピペッティングで細胞を剥離する。

　注：固い接着細胞（細胞細菌塊）は細胞スクレーパー、綺麗なピペットチップ、または最大量１mLのTRIzol NC試薬を入れることで剥離できる。或いは、トリプシンを使った後TRIzol NC試薬を入れて、懸濁細胞用のステップに従って細胞を剥離することもできる。

1.3.3混合液を1.5mLの遠心分離管に移動し、細胞が完全に溶解されるまでボルテックスまたはピペットで上下に動かして、室温で5分間培養する。

2．RNAの抽出

2.1上記の可溶化液に希釈緩衝液を添加

2.1.1 動物/植物組織：500μLのTRIzol NC試薬に100μLの希釈緩衝液を添加する。溶液が均質エマルジョンになるまで徹底的にボルテックスする。室温で5分間培養する。

2.1.2細胞：500μLのTRIzol NC試薬ごとに150μLの希釈緩衝液を添加する。遠心分離管の蓋をしっかり閉めて、溶液が均質エマルジョンになるまで徹底的にボルテックスする。室温で5分間培養する。

　注：溶液が均一溶液に完全に混合されていることを確保するべきである。さもなければRNA抽出と障害物除去の効率に悪影響が生じる。

2.2室温で11,200rpm (12,000×g)で15分間遠心分離する。

2.3 注意を払って遠心分離管を取り出す。この時、サンプルの中のタンパク質、DNAや多糖体などの不純物は管の底に沈殿され、RNAは上清で分散され、注意を払い、上清溶液（約500μL）を新しい遠心分離管に転移する。

　注：抽出の為に約500μLのTRIzol NC試薬が使われたのなら、総体積の約90%を取り込む上水相は約500μLである。下のペレットを吸引することで、ゲノムと不純物の汚染に導く。

　注：一部のサンプルの上清が少し濁っているか、または色ついている可能性もあるが、製品の量と精度を影響することはないので、下記のステップに従い実行しても大丈夫です。

　注：組織インプットの量が50mgの場合、上清溶液の量は450μLに減らし、ペレットを転移することを避けるのを推奨する。

2.4等量のイソプロパノールを得られた上清に添加する。浸潤でよく混合して、室温で10分間培養する。

2.5　11,200rpm (12,000×g)で室温で10分間遠心分離する。その後、ゲル状のRNAペレットは管の側や底で確認できる。上清を注意深く廃棄し、ペレットを失わないように注意を払うべきである。

　注：低含有量のRNAはペレットが見え難くなることに導きので、ペレットを失わないように注意を払いながら上清を廃棄すべきである。

　注：不純物の残物を減らすため、このステップでできるだけ遠く上清を廃棄して、ペレットを失わないように注意していください。

2.6 1mLの75%のエタノール（RNaseフリーのddH₂Oで調製）を添加する。ペレットを再懸濁するため、管をゆっくりフリックして、数回逆さまにする。

2.7 11,200rpm (12,000xg) で室温で3分間遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットを失わないように注意していください。

2.8ステップ6と7をもう一回繰り返す。上清を廃棄する。

　注：残基上清を減らすためには、上清はできるだけ廃棄するべきである。上清のほとんどを廃棄し、短く遠心分離してすべての液体を管の底に集め、その後残された液体を10μLのピペットで吸引し、ペレットを失わないように注意を払うことを推奨する。

2.9クリーンベンチ内で室温で自然乾燥させる。20-100μLのRNase-フリーのddH₂Oを添加してペレットを溶解し、室温で3分間ボルテックスし（またはピペットで上下に動かして）、徹底的に溶解させる。長期間の保存のため、RNAは小分けし、-85 ~ -65°Cで保存し、短期間の保存は、-30 ~ -15°Cで保存するべきである。

　注：RNAペレットを2-3分間自然乾燥させる。RNAを完全に乾燥すれば再懸濁が難しくなるのでペレットの過度な乾燥はしないでください。RNAは完全に再懸濁するべきであり、さもなければ濃度の低量は不正確になる可能性がある。

III FAQとトラブル対応