HADA (Synonyms: HCC-Amino-D-alanine hydrochloride)

Este protocolo solo proporciona una guía y debe modificarse según sus necesidades específicas.

1. Prepare las siguientes soluciones con antelación: TSB (o LB), placa de agar TSB (LB), solución stock de HADA de 50 mM (en DMSO), búfer de citrato de sodio 10× y 1×, PBS 1× y paraformaldehído al 3%.

2. Descongele el stock de glicerol de la cepa bacteriana en hielo. Use un asa de inoculación para estriar la cepa en placas de agar TSB y deje incubar durante la noche a 37 °C. Luego, inocule 25 ml de medio TSB (o LB) con una sola colonia bacteriana y deje incubar durante la noche a 37 °C.

3. Diluya el cultivo nocturno hasta un OD578 de 0.1 en medio TSB (o LB) y crezca a 37 °C hasta alcanzar un OD578 exponencial de 0.4.

4. Las células se diluyeron a OD578 0.1 usando TSB (o LB) precalentado a 37°C, y se colocaron 500 μl en un microtubo estéril de 1.5 ml.

5. Agregue 2.5 µl de solución stock de HADA 50 mM a la muestra para una concentración final de 250 μM y deje incubar a 37 °C con agitación durante 30 minutos.

6. Agregue una décima parte del volumen final de búfer de citrato de sodio 10× preenfriado (50 µl, pH 2.25) al cultivo en crecimiento.

7. Centrifugue la muestra a 16,200 xg durante 2 minutos a 4 °C. Deseche el sobrenadante y resuspenda el precipitado usando 1.5 ml de búfer de citrato de sodio 1× frío (pH 3.0).

8. Centrifugue la muestra a 16,200 xg durante 2 minutos a 4 °C. Deseche el sobrenadante y resuspenda el precipitado usando 1.5 ml de PBS 1× frío (pH 7.4), luego centrifugue la muestra nuevamente. Repita el paso de lavado una vez más con PBS 1× frío (pH 7.4). Descarte cuidadosamente el sobrenadante sin tocar el precipitado celular.

9. Fije las células resuspendiendo el pellet celular en 12.5 µl de PBS 1× y 12.5 µl de paraformaldehído al 3%. Mezcle bien con una pipeta y guarde en hielo o a 4 °C hasta el análisis microscópico.

10. Análisis microscópico: Pipetee 3 μl de células fijadas en el pozo de un portaobjetos de microscopio con agarosa preparado y coloque cuidadosamente un cubreobjetos cuadrado encima, presionando suavemente. Las células marcadas se analizaron usando un microscopio Eclipse Ti (objetivo Plan Fluor ×100/1.30 Aceite Ph3 DLL) equipado con una cámara Cool SNAP HQ2CCD, utilizando canales de contraste de fase y DAPI (longitud de onda de excitación 350/50 nm, longitud de onda de emisión 460/50 nm). Se utilizó un tiempo de exposición de 100 ms para el análisis de contraste de fase y un tiempo de exposición de 1 s para el análisis de imagen de fluorescencia.

Notas:

1. Antes de su uso, filtre con una membrana de filtro de 0.22 μm y preenfríe en hielo el búfer de citrato de sodio 10× y 1×, el PBS 1× y la solución de paraformaldehído al 3%.

2. HADA tiene una fluorescencia muy baja a pH ácido o en agua no tamponada, y las células observadas a un pH superior a 7.0 muestran el máximo brillo del etiquetado con HADA. Los dos últimos pasos de lavado son críticos.

3. El análisis microscópico de las células etiquetadas debe realizarse inmediatamente después de la fijación.

4. Con este protocolo, todas las células analizadas estaban completamente etiquetadas, mostrando señales más fuertes en los septos de las células en contracción. La adición de búfer de citrato de sodio 10× a las células en crecimiento, los lavados iniciales con búfer de citrato de sodio 1×, pH 3.0, y el procesamiento rápido de las muestras en hielo pueden mejorar la eliminación de HADA no incorporado y reducir las señales de fluorescencia de fondo, mejorando así la detección de señales.

Referencias:

[1] Peters K, Pazos M, VanNieuwenhze M S, et al. Optimized Protocol for the Incorporation of FDAA (HADA Labeling) for in situ Labeling of Peptidoglycan[J]. Bio-protocol, 2019, 9(15): e3316-e3316.