HADA (Synonyms: HCC-Amino-D-alanine hydrochloride)

Das Protokoll dient nur als Richtlinie. Bitte entsprend den Bedürfnissen ändern.
1. Die folgenden Lösungen im Voraus vorbereiten: TSB (oder LB), TSB (LB) Agarplatten, 50 mM HADA-Stammlösung(in DMSO), 10× und 1× Natriumcitratpuffer, 1×PBS und 3% Paraformaldehyd.
2. Das bakterielle Glycerin-Stock auf Eis auftauen. Mit einem Impfstrich die Bakterien auf TSB-Agarplatten ausstreichen und über Nacht bei 37 °C inkubieren. Dann eine einzelne Kolonie in 25 ml TSB-(oder LB-)Medium über Nacht bei 37 °C kultivieren.
3. Die Übernacht-Kultur im TSB-(oder LB-)Medium bis zu einem OD₅₇₈-Wert von 0.1 verdünnen. Bei 37 °C bis zum exponentiellen Wachstum mit einem OD₅₇₈-Wert von 0.4 kultivieren.
4. Die Zellen mit auf 37°C vorgewärmtem TSB-(oder LB-)Medium auf OD₅₇₈ 0.1 verdünnen. 500 μl der Suspension in ein steriles 1.5ml-Reagenzglas geben.
5. 2.5 µl der 50 mM HADA-Stammlösung hinzufügen(Endkonzentration: 250 μM). Dann 30 Minuten bei 37 °C unter Schütteln inkubieren.
6. Eiskalten 10× Natriumcitratpuffer(50 µl, pH 2.25) hinzugeben. Das Volumen beträgt ein Zehntel des Gesamtvolumens der Kultur.
7. Die Probe 2 Minuten lang bei 4 °C und 16,200 xg zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und das Pellet in 1.5 ml eiskaltem 1× Natriumcitratpuffer(pH 3.0) resuspendieren.
8. Erneut 2 Minuten bei 4 °C und 16,200 xg zentrifugieren. Überstand entfernen, Pellet in 1.5 ml eiskaltem 1 x PBS (pH 7.4) aufnehmen und nochmals zentrifugieren. Den Waschvorgang einmal mit eiskaltem PBS wiederholen. Den Überstand vorsichtig abgießen, ohne das Zellpellet zu berühren.
9. Zur Fixierung die Zellen in 12.5 µl 1×PBS und 12.5 μl 3% Paraformaldehyd resuspendieren. Mit der Pipette gut vermischen und bis zur mikroskopischen Analyse auf Eis oder bei 4 °C lagern.
10. Mikroskopische Analyse: 3 μl fixierte Zellen auf einen vorbereiteten Agarose-Objektträger geben. Vorsichtig ein quadratisches Deckgläschen auflegen und leicht andrücken. Die markierten Zellen werden am Eclipse Ti Mikroskop(Plan Fluor×100/1.30 Oil Ph3 DLL objective) ausgewertet. Eine Cool SNAP HQ2CCD Kamera wird verwendet. Die Analyse erfolgt im Phasenkontrast und im DAPI-Kanal(Anregungswellenlänge: 350/50 nm; Emissionswellenlänge: 460/50 nm). Belichtungszeit für Phasenkontrast: 100 ms; Belichtungszeit für Fluoreszenz-Aufnahme: 1s.
Hinweise:
1. Vor Nutzung die Puffer(10× and 1× Natriumcitratpuffer, 1× PBS und 3% Paraformaldehyd) durch ein 0.22 μm Filter filtrieren und auf Eis vorkühlen.
2. Bei saurem pH-Wert oder ungepuffertem Wasser zeigt HADA kaum Fluoreszenz. Bei einem pH-Wert über 7.0 erreicht die HADA-Markierung maximale Helligkeit. Die letzten beiden Waschschritte sind ziemlich wichtig.
3. Die mikroskopische Analyse soll unmittelbar nach der Zellfixierung erfolgen.
4. Mit diesem Protokoll können alle Zellen vollständig markiert werden. Besonders starke Signale entstenen an der Teilungsebene sich teilender Tzellen. Die Zugabe von 10× Natriumcitratpuffer zu wachsenden Zellen, anfängliche Waschvorgänge mit 1× Natriumcitratpuffer, pH 3.0 sowie die schnelle Probenverarbeitung auf Eis können ungebundenes HADA besser entfernen. Dadurch wird die Hintergrund-Fluoreszenzsignalen reduziert und die Signalerkennung wird erhöht.

References:
[1] Peters K, Pazos M, VanNieuwenhze M S, et al. Optimized Protocol for the Incorporation of FDAA (HADA Labeling) for in situ Labeling of Peptidoglycan[J]. Bio-protocol, 2019, 9(15): e3316-e3316.