HADA (Synonyms: HCC-Amino-D-alanine hydrochloride)

이 프로토콜은 지침을 제공하고 구체적인 요구에 따라 수정되어야 합니다.

1.다음 용액을 미리 준비하십시오: TSB (또는 LB), TSB (LB) 아가르 판, 50 mM HADA 원액(DMSO에 녹여), 10× 및 1× 구연산 나트륨 버퍼, 1배 PBS 및 3% 파라포름알데히드.

2. 얼음 위에서 박테리아 균주의 기뢰 저장액을 녹입니다. 재배양 루프를 사용하여 TSB 아가르 판에 줄무늬로 그은 37°C에서 통기하여야 합니다. 그 후 TSB (또는 LB) 매체에 하나의 박테리아 균주을 접중하고 37°C에서 통기하여야 합니다.

3.TSB (또는 LB) 매체에서 통기하여야 OD578을 0.1로 희석하고 37°C에서 배양하고 지수 성장기의 OD578이 0.4에 도달할 때까지 성장시킵니다.

4. TSB (또는 LB)를 37°C로 예열하고 세포를 OD578 0.1까지 희석하고 500μl를 멸균된 1.5 ml 마이크로 튜브에 넣습니다.

5.샘플에 50 mM HADA 원액 2.5 µl를 추가하여 최종 농도를 250 μM로 하고 37°C에서 흔들며 30분 동안 재배합니다.

6.성장 중인 배양물에 미리 냉각된 10배 나트륨 버퍼의 최종량의 열분의 일 (50 µl, pH 2.25)을 추가합니다.

7. 4°C에서 16,200 xg로 샘플을 2분간 원심분리합니다. 초산액을 버리고 얼음 차가운 1× 구연산나트륨 버퍼 (pH 3.0) 1.5 ml로 침전물을 재수정합니다.

8.4°C에서 16,200 xg로 샘플을 2분간 원심 분리합니다. 상청을 버리고 얼음 차가운 1× PBS (pH 7.4) 1.5 ml로 침전물을 재수정한 후 샘플을 다시 원심분리합니다. 얼음 차가운 1×PBS (pH 7.4)로 씻기 단계를 한 번 더 반복합니다. 세포 침전물을 건드리지 않고 상청을 조심해서 버리세요.

9. 세포를 12.5 µl 1×PBS와 12.5 μl 3% 패라포맄을 재수정하여 고정합니다. 피펫으로 잘 혼합하고 얼음 위나 4°C에서 마이크로스코피 분석할 때까지 보관합니다.

10. 현미경 분석: 고정된 세포 3 μl을 준비된 현미경에 아가르 슬라이드의 웰에 피펫하고 사각 조심 스럽게 올려 살짝 누르면서 놓습니다. 레이블된 세포를 Eclipse Ti 현미경 (Plan Fluor×100/1.30 Oil Ph3 DLL 목록)에 Cool SNAP HQ2CCD 카메라로 위상대조와 DAPI 채널 (발광파장 350/50 nm, 방출파장 460/50 nm)을 사용하여 분석합니다. 위상대조 분석은 100 ms의 노출 시간을 사용하고 형광 이미지 분석은 1 s의 노출 시간을 사용합니다.

노트:

1.사용하기 전에 0.22 μm 필터 막을 사용하여 필터하고 10×및 1× 구연산 나트륨 버퍼, 1× PBS와 3% 패라포맄 용액을 얼음 위에서 냉각시킵니다.

2.HADA는 산성 pH나 무버퍼드 물에서 거의 형광을 띄지 않고 pH 7.0 이상에서의 세포 이미지에서 HADA 표시의 최대 밝기를 보입니다. 마지막 두 씻기 단계는 매우 중요합니다.

3. 레이블된 세포의 현미경 분석은 고정 직후에 수행되어야 합니다.

4.이 프로토콜을 사용하면 모든 분석된 세포가 완전히 레이블링되어 수축하는 세포의 septa에서 더 강한 신호를 보입니다. 성장 중인 세포에 10× 소다시트레이트 버퍼를 추가하고 pH 3.0의 1× 구연산 나트륨 버퍼로 최초 씻기를 진행하고 얼음 위에서 샘플을 빠르게 처리하면 미결합된 HADA의 제거율을 높이고 배경 형광 신호를 줄이고 신호 검출을 향상시킬 수 있습니다.

References:

[1] Peters K, Pazos M, VanNieuwenhze M S, et al. Optimized Protocol for the Incorporation of FDAA (HADA Labeling) for in situ Labeling of Peptidoglycan[J]. Bio-protocol, 2019, 9(15): e3316-e3316.