HADA (Synonyms: HCC-Amino-D-alanine hydrochloride)

Ce protocole fournit seulement une directive et doit être modifié en fonction de vos besoins spécifiques.

1.Préparer à l'avance les solutions suivantes : TSB (ou LB), plaque d'agar TSB (LB), solution de stock HADA à 50mM (dans DMSO), tampon de citrate de sodium 10× et 1×, 1×PBS et 3% paraformaldéhyde.

2.Décongeler la réserve de glycérol de la souche bactérienne sur la glace. Utiliser une boucle d'ensemmencement pour étaler la souche sur les plaques d'agar TSB et incuber toute la nuit à 37°C. Ensuite, inoculer 25ml milieu TSB (ou LB) avec une seule colonie bactérienne et incuber toute la nuit à 37°C.

3.Diluer la culture pendant la nuit à OD₅₇₈ de 0.1 dans un milieu TSB (ou LB) et faites croître à 37°C jusqu'à ce qu'elle atteigne OD₅₇₈ exponentielle de 0,4.

4.Diluer les cellules à OD₅₇₈ de 0.1 par voie d'utiliser TSB (ou LB) préchauffé à 37°C, et placer 500µl dans un micro-tube stérile de 1,5ml.

5.Ajouter 2,5µl solution de stock HADA à 50mM à l'échantillon pour obtenir une concentration finale de 250µM et incuber à 37°C avec agitation pendant 30 minutes.

6.Ajouter un dixième du volume final de tampon de citrate de sodium 10× pré-refroidi (50 µl, pH 2.25) à la culture en croissance.

7.Centrifuger l'échantillon à 16,200 xg pendant 2 minutes à 4 °C. Le surnageant est jeté et le précipité est remis en suspension par voie d'utiliser 1,5ml tampon de citrate de sodium 1× glacé (pH 3,0).

8.Centrifuger l'échantillon à 16,200 xg pendant 2 minutes à 4 °C. Le surnageant est jeté et le précipité est remis en suspension au moyen d'utiliser 1,5ml PBS 1 x glacé (pH 7.4), puis l'échantillon est centrifugé à nouveau. Répéter l'étape de lavage une fois avec PBS 1× glacé (pH 7.4). Jeter soigneusement le surnageant sans toucher le précipité cellulaire.

9.Fixer les cellules par voie de remettre le culot cellulaire en suspension dans 12,5µl PBS 1× et 12.5 μl paraformaldéhyde à 3%. Mélanger bien avec une pipette et conserver sur la glace ou à 4°C jusqu'à l'analyse microscopique.

10.Analyse microscopique : 3µl cellules fixées ont été pipetés dans le puits d'une lame d'agarose pour microscope préparée, et une lamelle carrée a été soigneusement placée dessus, en appuyant délicatement. Les cellules marquées ont été analysées à l'aide d'un microscope Eclipse Ti (objectif Plan Fluor×100/1.30 Oil Ph3 DLL) équipé d'une caméra Cool SNAP HQ2CCD, par voie d'utiliser le contraste de phase et les canaux DAPI (longueur d'onde d'excitation 350/50 nm, longueur d'onde d'émission 460/50 nm). Un temps d'exposition de 100 ms a été utilisé pour l'analyse en constraste de phase, et un temps d'exposition de 1 s a été utilisé pour l'analyse d'image en fluorescence.

Remarques :

1.Avant utilisation, filtrez avec une membrane filtrante de 0,22µm et pré-refroidissez le tampon de citrate de sodium 10× et 1×, PBS 1× et la solution de paraformaldéhyde à 3% sur la glace.

2.HADA est presque fluorescent à pH acide ou dans de l'eau non-tamponée, et les cellules imagées à pH supérieur à 7,0 montrent la luminosité maximale du marquage de HADA. Les deux dernières étapes de lavage sont cruciales.

3.L'analyse microscopique des cellules marquées doit être effectuée immédiatement après la fixation.

4.Avec ce protocole, toutes les cellules analysées ont été complètement marquées, il présente les signaux plus forts au niveau des septum des cellules en contraction. L'ajout de tampon de citrate de sodium 10× aux cellules en croissance, les lavages initiaux avec tampon de citrate de sodium 1×, pH 3.0, et le traitement rapide des échantillons sur la glace peuvent améliorer l'élimination de HADA non-incorpée et entraîner une réduction des signaux de fluorescence de fond et une augmentation de la détection du signal.

References:
[1] Peters K, Pazos M, VanNieuwenhze M S, et al. Optimized Protocol for the Incorporation of FDAA (HADA Labeling) for in situ Labeling of Peptidoglycan[J]. Bio-protocol, 2019, 9(15): e3316-e3316.