JC-1 (Synonyms: CBIC2;JC1;JC 1)

Protocole d'analyse du potentiel de membrane mitochondriale des cellules [1] :

1) Préparer une solution mère de 5mg/mL de JC-1 dans du DMSO (~7,7 mM). JC-1 est sensible à la lumière. Ne pas l'exposer à une lumière directe et intense. Effectuer toutes les procédures de coloration sous une lumière tamisée. Éviter les congélations/décongélations répétées de la solution mère de JC-1. Faire de petites aliquotes après la première décongélation et les conserver à 20℃.

2. Cultiver des cellules sur une lamelle couvre-objet en verre dans une boîte de Pétri ou dans une lame de chambre. Induire les cellules selon votre protocole spécifique.

3. Réchauffer le milieu de culture frais à 37℃. Décongeler une aliquote de la solution mère JC-1 à température ambiante (RT). S'assurer que JC-1 est complètement décongelé et réchauffé à la température ambiante avant de le diluer. Bien mélanger JC-1 décongelé avant de le diluer. Préparer la solution de coloration JC-1 en diluant le réactif dans un milieu de culture préchauffé. Pour la coloration des cellules adhérentes, JC-1 est dilué dans le milieu à une concentration finale de ~ 5 ug/mL (vortexer pendant la dilution pour éviter la formation de précipités). Bien mélanger pour dissoudre toutes les particules. Ne pas centrifuger le réactif. Diluer le réactif JC-1 immédiatement avant utilisation.

4. Retirer le milieu de culture cellulaire et le remplacer par une quantité suffisante de réactif JC-1 1X dilué pour couvrir les cellules.

5.Incuber les cellules pendant 10 minutes à 37℃ (ou RT pendant 15 minutes). La durée de la coloration dépend du type de cellule.

6.Retirer le milieu et laver la monocouche deux fois avec du PBS ou du milieu frais.

7. Ajouter une goutte de PBS et recouvrir les cellules d'une lamelle couvre-objet.

8. Observer immédiatement les cellules à l'aide d'un microscope à fluorescence utilisant un filtre à double bande passante conçu pour détecter simultanément la fluorescéine et la rhodamine ou la fluorescéine et le Texas Red. Dans les cellules vivantes non apoptotiques, les mitochondries apparaissent en rouge après l'agrégation de réactif JC-1. Les agrégats rouges émettent à environ 590 nm. Dans les cellules apoptotiques et mortes, le colorant reste sous sa forme monomérique et apparaît en vert avec une émission à environ 530 nm.

Protocole d'essai fonctionnel JC-1 pour la glycoprotéine P (Pgp) [2] :

1.Pour la coloration, les cellules ont été lavées deux fois et remises en suspension dans du PBS contenant 0,1 μM de JC-1 monomère à une concentration de 5x105 cellules/mL et incubées à 37℃ pendant 15 sans ou avec modulateur pour évaluer la fonction Pgp.

2. Les cellules ont été lavées deux fois dans du PBS froid et les échantillons ont été analysés.

3.La fluorescence des cellules a été enregistrée à l'aide d'un cytomètre de flux FACSort équipé d'un laser à argon de 488 nm et de 3 détecteurs de fluorescence : FL1 (filtre passe-bande 530 nm), FL2 (filtre passe-bande 585 nm) et FL3 (filtre passe-bande 650 nm).

4.Les fluorescences de JC-1 ont été analysées sur les canaux FL1 et FL2 pour la détection de la fluorescence du monomère du colorant et de la forme cristal liquide, respectivement. La fonction de la Pgp a été établie avec des cellules blastiques sélectionnées par l'anticorps CD34 ou avec des caractéristiques physiques uniquement si les cellules blastiques n'exprimaient pas de marqueurs caractéristiques.

Ce protocole ne constitue qu'une ligne directrice et doit être modifié en fonction de vos besoins spécifiques.