ADHP(Amplex Red) (Synonyms: A 6550, ADHP, Amplex Red) |
カタログ番号GB30275
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Amplex Redは過酸化水素の濃度またはペルオキシダーゼの活性の測定に使われている。
Products are for research use only. Not for human use. We do not sell to patients.
Cas No.: 119171-73-2
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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Amplex Redは過酸化水素の濃度またはペルオキシダーゼの活性の測定に使われている。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）の存在下で、Amplex Red（ADHP）は1:1の化学量論比でH₂O₂と反応し、蛍光性の高いResorufinを生成する。Amplex Red試薬から生成されたResorufinの生成物は、530-560 nmの励起波長と590 nmの発光波長を持つ蛍光マイクロプレートリーダーで簡単に読み取れる。同じサンプル内で、蛍光値はH₂O₂またはペルオキシダーゼの濃度に比例している。未知のサンプルで、H₂O₂またはペルオキシダーゼの含有量を、Amplex Redで作成された標準曲線と結果を比べることで測定した。
保存：
受領の後、ADHPプローブとHRPを小分けし、-20ºCで保存する。複数回の冷凍/解凍循環を避けるべきである。残りのキット成分を4℃で保存する。ADHPは光に敏感であるため、適切に保存しなければならない。
試薬の調製
注：全ての試薬は、使用前に室温に戻さなければならない。
• 1X アッセイバッファー：50 mM Tris–HClバッファー pH7.4
• ADHP原液：DMSOに溶解した10 mMの溶液
• HRP原液：グリセロールに溶解した100 U/mLの溶液*
• H2O2原液：8.8 Mの溶液
*注：pH 6.0と20ºCで、20秒で、pyrogallolから1.0 mgのpurpurogallinを形成する酵素の量を1単位と定義する。
• ADHP/HRP作業溶液（過酸化水素アッセイ）：過酸化水素を測定する場合は、1X アッセイバッファーで、ADHPを100 µMの最終濃度に、HRPを0.2 U/mLの最終濃度になるまで添加することでADHP/HRP作業溶液を調製する（例えば：50 µL ADHP原液と10 µL HRP原液を、4.940 mL 1Xアッセイバッファーに添加する）。この量は、~100回のアッセイに充分である。ADHP/HRP作業溶液は1日間安定していられる。速やかに使用するのに必要な量だけ調製してください。
• ADHP/H2O2 作業溶液（ペルオキシダーゼアッセイ）：ペルオキシダーゼを測定する場合は、1X アッセイバッファーで、ADHPを100 µMの最終濃度に、H2O2を2 mMの最終濃度になるまで添加することでADHP/H2O2作業溶液を調製する。まずは1X アッセイバッファーで原液H2O2を1:1000に希釈する。速やかに使用するのに必要な量だけを使う（例えば：5 μLのH2O2を4.995 mL 1X アッセイバッファーに添加する）。この溶液の濃度は8.8 mMである、この8.8 mM H2O2溶液で、ADHP/1Xアッセイバッファーで2 mM H2O2溶液を調製する（例えば：50 µL ADHP原液と調製済みの8.8 mM H2O2溶液1.14 mLを3.81 mL 1Xアッセイバッファーに添加する）。この量は、~100回のアッセイに充分である。この作業溶液は1日間安定していられる。速やかに使用するのに必要な量だけ調製してください。
サンプルの用意
•細胞培養上清：不溶性の粒子を除去するために、10,000 rpmで5分間遠心分離する。上清は、直接に分析され、
または必要に応じて希釈されることが可能である。同じ非調整の培地で、H2O2標準曲線を作成する。血清はアッセイを干渉するので、避けるべきである。注：高いpH値（>8.5）ではADHPが不安定なので、最適な作業条件のために、pHを7から8の間に維持するべきである。
•細胞の溶解液：PBSまたは1X アッセイバッファーで、1-2 x 106個の細胞/mLで細胞を懸濁する。氷の上で細胞を均質化または超音波処理する。遠心分離することでデブリを除去する。細胞の溶解液は希釈せずにアッセイすることも、必要に応じて滴定することも可能である。
•血漿、血清または尿：不溶性の粒子を除去するために、10,000 rpmで5分間遠心分離する。上清は直接的にアッセイすることも、必要に応じて希釈することも可能である。未希釈の血清または血漿は、アッセイを干渉する恐れがある。
注意事項：
• 全てのサンプルは速やかに分析し、または-80℃で最大1-2か月間保存するべきである。必要に応じて適切な対照実験を行うべきである。サンプルの最適実験条件は、研究者が決めなければならない。常にサンプルの標準曲線を作成するべきである。
• 存在している総H2O2またはペルオキシダーゼに応じて、段階希釈が必要になる。極めて高いレベルのH2O2（≥ 500 µMの最終濃度）またはペルオキシダーゼ（≥ 100 mU/mL）は蛍光を下げる可能性がある。それは、過剰なH2O2またはペルオキシダーゼが更に、反応生成物Resorufinを非蛍光性の生成物Resazurinに酸化できるからである。
• 10 μM以上の濃度のNADHと50 μM以上の濃度のグルタチオンのサンプルは、ADHPプローブを酸化し、間違った読み取りをもたらす可能性がある。このような干渉を最小限に抑えるために、40 U/mLの最終濃度でスーパーオキシドジスムターゼ（SOD）を反応液に添加することを推奨する。
• チオール（10 μM以上）の存在下に、Resorufinが不安定なため、DTTまたはβ-メルカプトエタノールを含有するサンプルを避けるべきである。
標準曲線の作成
• H2O2標準：H2O2標準液を調製するために、まずは1X アッセイバッファーでH2O2原液の1:1000の希釈を行う。速やかな使用前に必要な量だけを用意する（例えば：4.995 mL 1X アッセイバッファーに5 μLのH2O2を添加する）。この溶液の濃度は8.8 mMである。この8.8 mM H2O2溶液を使い、1X アッセイバッファーで更に希釈する（例えば：11.5 µLのH2O2を988.5 µL 1X アッセイバッファーに添加する - 下記の表1を参照）ことで、0 µM – 100 µMの濃度範囲内で標準液を用意する。H2O2希釈溶液と標準液を新鮮に用意するべきである。
| Cas No. | 119171-73-2 | SDF | |
| 同義語 | A 6550, ADHP, Amplex Red | ||
| Formula | C14H11NO4 | M.Wt | 257.24 |
| 溶解度 | DMSO : 125 mg/mL (485.93 mM; Need ultrasonic) | Storage | Store at -20°C, protect from light |
| General tips | Please select the appropriate solvent to prepare the stock solution according to the
solubility of the product in different solvents; once the solution is prepared, please store it in
separate packages to avoid product failure caused by repeated freezing and thawing.Storage method
and period of the stock solution: When stored at -80°C, please use it within 6 months; when stored
at -20°C, please use it within 1 month. To increase solubility, heat the tube to 37°C and then oscillate in an ultrasonic bath for some time. |
||
| Shipping Condition | Evaluation sample solution: shipped with blue ice. All other sizes available: with RT, or with Blue Ice upon request. | ||
| Prepare stock solution | |||
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1 mg | 5 mg | 10 mg |
| 1 mM | 3.8874 mL | 19.4371 mL | 38.8742 mL |
| 5 mM | 777.5 μL | 3.8874 mL | 7.7748 mL |
| 10 mM | 388.7 μL | 1.9437 mL | 3.8874 mL |
Step 1: Enter information below (Recommended: An additional animal making an allowance for loss during the experiment)
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μL
Step 2: Enter the in vivo formulation (This is only the calculator, not formulation. Please contact us first if there is no in vivo formulation at the solubility Section.)
Calculation results:
Working concentration: mg/ml;
Method for preparing DMSO master liquid: mg drug pre-dissolved in μL DMSO ( Master liquid concentration mg/mL, Please contact us first if the concentration exceeds the DMSO solubility of the batch of drug. )
Method for preparing in vivo formulation: Take μL DMSO master liquid, next addμL PEG300, mix and clarify, next addμL Tween 80, mix and clarify, next add μL saline, mix and clarify.
Method for preparing in vivo formulation: Take μL DMSO master liquid, next add μL Corn oil, mix and clarify.
Note: 1. Please make sure the liquid is clear before adding the next solvent.
2. Be sure to add the solvent(s) in order. You must ensure that the solution obtained, in the previous addition, is a clear solution before proceeding to add the next solvent. Physical methods such as vortex, ultrasound or hot water bath can be used to aid dissolving.
3. All of the above co-solvents are available for purchase on the GlpBio website.
Quality Control & SDS
- View current batch:
- Purity: >98.00% Appearance: A solid
- COA (Certificate of Analysis)
- SDS (Safety Data Sheet)
- Datasheet
Average Rating: 5 (Based on Reviews and 30 reference(s) in Google Scholar.)