NBD-Pen

このプロトコールは参考までであり、ご自分の具体的な需要に応じてご調整下さい。

I.NBD-Penは、DENに誘発されたラットの肝臓における脂質フリーラジカルの検出に使われる。

1.体重1kgあたり100mgのジエチルニトロソアミン（DEN）を、8週齢のF344雄ラットに単回腹腔内注射した。

2.DENの投与後（1、6または24時間）、塩酸メデトミジン、ミダゾラムとブトルファノールの溶液で、8週齢のF344雄ラットを麻酔した。

3.麻酔されたラットに、50%のポリエチレングリコール300（PEG300）に溶解した2mM NBD-Pen（体重1kgあたり1ml）を静脈内注射した。

4.NBD-Pen蛍光測定

4.1.麻酔剤の過剰投与による安楽死の後、肝臓を摘出し、三倍量（w/v）の冷却1.15% KCl溶液のPotter型ホモジナイザーを使い、組織サンプルをホモジナイズした。

4.2.ホモジナイズした肝臓と血清サンプルにおけるタンパク質の含有量をBCAタンパク質アッセイキット（カタログ番号：GK10009）で測定した。

4.3.Bligh & Dyer法^[2]で肝臓と血清サンプルから抽出した脂質溶液を使い、蛍光マイクロプレートリーダーで、NBD-Penの蛍光強度（λex/λem = 470/530nm）を測定した。

5.肝臓切片の蛍光イメージング

5.1.ラットの肝臓に由来する凍結組織切片を、DAPI Fluoromount-G Antifade Mounting Medium（カタログ番号：GB30154）のスライドガラスに載せた。

5.2.GFP-BPフィルター（λex = 470/40 nm、λem = 535/50nm）を搭載したBIOREVO BZ-9000を使い、各切片におけるNBD-Penの蛍光を可視化した。

II.NBD-Penは細胞における脂質フリーラジカルの検出に使われる。

1.1.原液の調製

無水DMSOを使い、10mMのNBD-Pen原液を調製する。

1.2.作業溶液の調製

予熱した無血清細胞培養培地またはPBSを使い、原液を希釈し、10μMのNBD-Pen作業溶液を調製する。

注：実際の条件に応じて、NBD-Pen作業溶液の濃度を調整し、使用する直前に調製してください。

2.分光学的測定法

2.1.100mMのリン酸緩衝液と0.5%のエタノールを使い、脂質（500μM）エマルジョンを調製する。

2.2.0.5%のアセトニトリルを含有するリン酸緩衝液で、このエマルジョンを5μM NBD-Penと混ぜる。

2.3.指示された濃度で、リン酸緩衝液の混合液の中に、LOXを添加し、インキュベートする。

2.4.蛍光発光とESR測定を行う。

2.5.励起と発光波長がそれぞれ470と530nmで、プローブの蛍光スペクトラを測定する。

2.6.Xバンド（9.45 GHz）ESR分光計を使い、ESRをモニタリングする。

3.細胞の調製と染色

3.1.細胞培養培地を廃棄し、PBS、10% FBSを含有する無フェノールレッド培養培地で細胞を3回洗浄する。

3.2.1μMのNBD-Penを添加し、10分間インキュベートする。

3.3.30mMのジエチルニトロソアミン（DEN）を添加する。

3.4.37℃、5% CO₂の加湿環境下で、蛍光イメージングを速やかに行う。

3.5.Hoechst33342（1μM）とSKF525A（50μM）を投与し、1時間インキュベートし、その後はPBSで洗浄する。

3.6.63xまたは40xの対物レンズを使い、共焦点レーザー顕微鏡で蛍光イメージングを実行する。

3.7.下記の検出レーザーを使う：Hoechst33342、λex = 405 nm、λem = 410-505 nm；NBD-Pen、λex = 458 nm、λem = 490-674 nm。