CY7-SE

라벨을 붙이는 단백질[1] :

다른 단백질(예:혈청 알부민 또는 젤라틴)을 함유한 항체나 아미노기를 가진 완충기는 표시에 영향을 미칠 수 있고 표시에 정제해야 합니다.

1.항GST 항체(3mg/mL, 0.5mL)를 실온에서 0.15M NaCl 용액 1L에 4시간 동안 투석합니다.

2.4°C에서 신선한 0.15M NaCl 용액 1L에서 밤새 투석시킵니다.

3.다음날에 0.1M NaHCO₃ (pH 8.3) 1L에서 4시간 동안 투석합니다.

4. 0.22-㎛ 주사기 필터를 사용해서 항체 용액을 여과합니다.

5. 0.1M NaHCO₃로 항체의 소량을 희석하고 280nm에서 자외선 흡광도를 측정해서 항체의 총량을 계산합니다.

6. DMSO에 10mg/mL 농도의 Cy7-SE 용액을 준비합니다. CyDye NHS와 항체의 원하는 비율(예: 20:1)을 달성하기 위해 필요한 부피를 계산한 후 이를 항체 용액에 천천히 추가합니다. 실온에서 어두운 곳에서 45분 동안 부드럽게 뒤섞합니다.

7. 미결합된 Cy7-SE를 제거하기 위해 1L의 0.15M NaCl 용액을 사용하고 실온에서 어두운 곳에서 4시간 동안 투석시킵니다.

8. 어두운 곳에서 4°C에서 신선한 1L의 0.15M NaCl 용액을 사용하고 밤새 투석합니다. 9. 1L의 0.01M PBS/0.01% 아자이드 나트륨 용액을 사용해서 실온에서 어두운 곳에서 4시간 동안 투석시키고 다시 4°C에서 어두운 곳에서 밤새 투석시킵니다. 10. 0.22㎛ 주사기 필터를 사용해서 항체 용액을 여과합니다.

11. 0.01M PBS/0.01% 아자이드 나트륨으로 표기된 항체 용액을 편리한 농도로 희석하고 280nm (단백질) 과 552nm (Cy) 에서 UV-Vis 흡광도를 측정합니다.

12. CY7-SE로 표시된 단백질을PBS 용액(pH=7.2-7.4)에 녹입니다.

13. 쥐 꼬리 정맥에 200μL (0.5mg/mL)을 정맥주사합니다.

14. 체내 형광의 영상 사진을 기록하고 형광 약물의 분포를 분석합니다.

15. 들뜨기 파장은 700–770nm bandpass, 방출 파장은 790nm longpass였습니다.

F/P (fluorophore-to-protein) 비율을 계산하려면 다음 단계를 따릅니다:

Cy7의 750nm에서의 몰 소멸 계수는 240600M⁻¹cm⁻¹입니다; 이 단백질의 280nm에서의 몰소멸 계수는 170,000M⁻¹cm⁻¹입니다. 다른 단백질은 다른 몰소멸 계수를 가지고 있습니다. Cy7 염료 자체의 280nm에서의 흡수는 750nm에서의 흡수의 4%입니다. F/P 값을 다음 공식을 사용해서 계산합니다:

[Cy7] = A₇₅₀/240600

[antibody] = {A₂₈₀ - (0.04×A₇₅₀)}/170000

F/P _final= [Cy7]/[antibody]= {0.71×A₇₅₀}/ {A₂₈₀ - (0.04×A₇₅₀)}

Reference:
[1] ZHANG C, CHENG H, DOU S, et al. Near-infrared fluorescent molecular probes with cetuximab in the in vivo fluorescence imaging for epithelial ovarian cancer [J]. J Ovarian Res, 2024, 17(1): 225.