Disuccinimidyl Suberate (Synonyms: DSS, NSC 340008)

El siguiente protocolo es un ejemplo de aplicación para este producto. Las aplicaciones específicas requerirán optimización.

Procedimiento para el entrecruzamiento de proteínas

A. Materiales necesarios

1. Dimetilsulfóxido (DMSO) o dimetilformamida (DMF) secos para usar con Disuccinimidil Suberato.

2. Buffer de conjugación: Usar un buffer sin aminas con un pH de 7 a 9, como 100 mM de fosfato de sodio, 0.15 M de NaCl; 20 mM de HEPES; 100 mM de carbonato/bicarbonato; o 50 mM de borato.

3. Buffer de neutralización: 1M Tris•HCl, pH 7.5 (también se puede usar 1M glicina o lisina). El reactivo no reaccionado puede eliminarse mediante diálisis o filtración en gel.

B. Procedimiento

1. Preparar la proteína en el buffer de conjugación.

2. Preparar el entrecruzador antes de usar. Disolver Disuccinimidil Suberato en DMSO o DMF. Pesar 2 mg de Disuccinimidil Suberato en un tubo de microcentrífuga y agregar 216 μL de solvente para obtener una concentración final de 25 mM.

3. Agregar el entrecruzador a la muestra de proteína. Si la concentración de la proteína es mayor a 5 mg/mL, usar un exceso molar de 10 veces del entrecruzador. Para muestras de menos de 5 mg/mL, usar un exceso molar de 20 a 50 veces. Utilizar una concentración final del entrecruzador de 0.25 a 5 mM.

4. Incubar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos o en hielo durante 2 horas.

5. Neutralizar la reacción añadiendo el buffer de neutralización a una concentración final de 20 a 50 mM de Tris. Alternativamente, eliminar el reactivo no reaccionado mediante diálisis o desalinización.

6. Incubar la reacción de neutralización a temperatura ambiente durante 15 minutos.

II. Reacciones de entrecruzamiento intracelular y extracelular

El entrecruzamiento puede realizarse en células en suspensión o en células adherentes en placas de cultivo. En este último caso, la difusión del reactivo de entrecruzamiento a todas las superficies de las células será limitada y ocurrirá predominantemente en la superficie expuesta. Es necesario lavar el medio de cultivo de las células, ya que los componentes que contienen aminas neutralizarán la reacción. Utilizar una suspensión celular más concentrada es más efectivo, ya que se requerirá menos reactivo en la reacción. Generalmente, una concentración final de 1 a 5 mM de reactivo es efectiva. Las reacciones de NHS ocurren más rápidamente con un pH creciente; por lo tanto, se utiliza un pH de 8.0 en el siguiente ejemplo para que la reacción se complete rápidamente.

A. Materiales necesarios

1. Solución del entrecruzador: disolver el Disuccinimidil Suberato en DMSO seco a una concentración de 10-25 mM antes de usar.

2. Solución salina amortiguada con fosfato (PBS): 20 mM de fosfato de sodio, 0.15 M de NaCl; pH 8. También se pueden usar tampones HEPES, bicarbonato/carbonato o borato con pH entre 7 y 9 como alternativas.

3. Solución de neutralización: 1M de Tris, pH 7.5 (Tris o glicina neutralizarán la reacción).

B. Procedimiento

1. Suspender las células a una concentración de 25×10^6 células/mL en PBS (pH 8.0).

2. Lavar las células tres veces con PBS helado (pH 8.0) para eliminar el medio de cultivo y proteínas que contienen aminas de las células. Para estudios de interacción de superficie celular, añadir ligandos a las células e incubar durante 1 hora a 4°C.

3. Añadir la solución de Disuccinimidil Suberato a una concentración final de 1-5 mM.

4. Incubar la mezcla de reacción durante 30 minutos a temperatura ambiente.

5. Añadir la solución de neutralización a una concentración final de 10-20 mM de Tris.

6. Incubar la reacción de neutralización durante 15 minutos a temperatura ambiente.

NOTAS:

1. El Disuccinimidil Suberato es sensible a la humedad. Para evitar la condensación de humedad en el producto, el vial debe equilibrarse a temperatura ambiente antes de abrirlo.

2. La fracción de éster NHS se hidroliza fácilmente y se vuelve no reactiva; por lo tanto, no preparar soluciones de reserva para almacenamiento.

3. El entrecruzamiento de proteínas con actividad biológica (es decir, enzimas, anticuerpos, etc.) puede resultar en la pérdida de actividad tras la conjugación, posiblemente causada por cambios conformacionales de la molécula. También puede ocurrir pérdida de actividad cuando el entrecruzador modifica los grupos lisina involucrados en la unión de sustrato o antígeno. Ajustar las proporciones molares del reactivo al objetivo puede contrarrestar la pérdida de actividad. Alternativamente, se puede utilizar un entrecruzador que dirija un grupo funcional diferente.

4. La hidrólisis del éster NHS es una reacción competitiva que aumenta con un pH creciente. La hidrólisis ocurre más fácilmente en soluciones diluidas de proteínas o péptidos. En soluciones concentradas de proteínas, se favorece la reacción de acilación.

Referencias

[1]. Partis M D, Griffiths D G, Roberts G C, et al. Cross-linking of protein by ω-maleimido alkanoyl N-hydroxysuccinimido esters[J]. Journal of Protein Chemistry, 1983, 2: 263-277.