Biotin-HPDP |
カタログ番号GC11037
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Biotin-HPDPはスルフヒドリル基反応性のビオチン化試薬であり、タンパク質のシステイン、そしてスルフヒドリル基を含有する基質の標識に使われている。
Products are for research use only. Not for human use. We do not sell to patients.
Cas No.: 129179-83-5
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
Biotin-HPDPはスルフヒドリル基反応性のビオチン化試薬であり、タンパク質のシステイン、そしてスルフヒドリル基を含有する基質の標識に使われている[1]。Biotin-HPDPは、タンパク質におけるS-ニトロソ化の検出、偽陽性シグナルの発生の減少に使える[2]。Biotin-HPDPは、マイクロカンチレバーセンサーの作製、ビオチンとストレプトアビジンの間の結合相互作用の研究に広く使われている[3]。
Biotin-HPDPによるスルフィド化の評価
このプロトコールはガイドラインのみを提供し、ご自分の特定のニーズに合わせてご調整願います。
1.細胞の染色用の原液と希釈溶液の調製
（1）Sulfo-NHS-SS-Biotinの粉末をDMSOに溶解することでBiotin-HPDP原液（50mM）を調製する。
（2）DMSOを使い、Biotin-HPDP原液を0.8mMの最終濃度に希釈する。注：作業溶液は、実験当日に新鮮に調製しなければならない。
2.細胞の調製
実験の規模に応じて、培養細胞を6ウェルのプレートまたは60mmの培養皿に播種する。細胞が剥離しやすい場合は、poly-l/d-lysineでプレートまたは皿をプレコーティングして細胞の接着を増強する。
3.細胞表面におけるビオチンの標識
（1）プレートを氷の上で10分間インキュベートする。このステップは、更なる輸送またはエンドサイトーシスを止め、細胞膜にあるタンパク質のみがビオチンで標識されることを確保する。
（2）細胞を氷冷PBSで洗浄する。
（3）0.8mMのBiotin-HPDPをプレートに添加し、4℃、暗所で30分間、ゆっくり攪拌しながら30分間インキュベートする。
（4）細胞をPBSで二回洗浄し、その後、4℃、1%のウシ血清アルブミンを含有するPBSで10分間インキュベートし、未結合のビオチンすべてをクエンチする。PBSの中の50mMのグリシン溶液も、反応のクエンチに使える。
（5）回収の前に、細胞をPBSで二回洗浄し、残存のクエンチ緩衝液を除去する。
（6）150mM NaCl、50mM Tris-HCl（pH 7.4）、1mM EDTA、1% Triton X-100とプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する溶解緩衝液で、細胞を1.5mlのチューブに採取する。通常、1つの6ウェルプレートのサンプルにあたり200-300μlの溶解緩衝液を使う。細胞膜を破壊し、サンプルを均質化するためには、細胞を短い間、超音波処理する。上清を新しい1.5mlのチューブに移す。
4.ストレプトアビジン-ビオチンのインキュベーション
（1）50μlの50% ストレプトアビジンレジンを1.5mlのチューブに添加する。ビーズ懸濁液を反転させ、またはボルテックスミキサーで処理することで、ストレプトアビジンのビーズをゆっくり再懸濁する。ビーズが使用前に完全に混合されることを確保するべきである。
（2）4℃、エンドオーバーエンドローテーターで、1mlの溶解緩衝液を使い、ビーズを1時間インキュベートすることで平衡化する。チューブを卓上遠心機で短い間遠心分離し、上清溶液を吸引除去する。平衡化洗浄をもう一度繰り返す。最後の洗浄後、ゲルローディングチップを使い、残りの溶解緩衝液全てを注意深く、完全に除去する。
（3）細胞溶解液をビーズに添加する。その後、適量の溶解緩衝液を添加し、総体積を200μl/サンプルにする。
（4）4℃、エンドオーバーエンドのローテーターで、溶解液とストレプトアビジンの混合液を4時間から一晩インキュベートする。
（5）卓上遠心機を使い、上清溶液を吸引除去する。1mlの溶解緩衝液を添加し、4℃、エンドオーバーエンドのローテーターで5分間洗浄する。洗浄を更に二回繰り返す。最後の洗浄後、ゲルローディングチップを使い、残りの溶解緩衝液全てを注意深く、完全に除去する。
5.溶出、可視化と定量化
（1）225mMのTris-HCl（pH 8.45）、6%のグリセロール、2%のドデシル硫酸ナトリウムと65mMのジチオトレイトールを含有するサンプル緩衝液でビオチン化タンパク質を溶出する。37℃で60分間インキュベートする。
（2）溶出されたサンプルをSDS-PAGEで分離し、免疫ブロット法を行う。
6.実験の注意事項
（1）Biotin-HPDPが加水分解にやすいため、使用の直前に、Biotin-HPDPをDMSOに溶解し、ビオチン溶液が光から十分に保護されていることを確保する。
（2）このプロトコールと試薬は全て、科学研究のみに使うべきである。
| Cas No. | 129179-83-5 | SDF | |
| Chemical Name | 5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]-N-[6-[3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoylamino]hexyl]pentanamide | ||
| Canonical SMILES | C1C2C(C(S1)CCCCC(=O)NCCCCCCNC(=O)CCSSC3=CC=CC=N3)NC(=O)N2 | ||
| Formula | C24H37N5O3S3 | M.Wt | 539.78 |
| 溶解度 | 5.4mg/mL in DMSO (ultrasonic and warming and heat) | Storage | Store at -20°C |
| General tips | Please select the appropriate solvent to prepare the stock solution according to the
solubility of the product in different solvents; once the solution is prepared, please store it in
separate packages to avoid product failure caused by repeated freezing and thawing.Storage method
and period of the stock solution: When stored at -80°C, please use it within 6 months; when stored
at -20°C, please use it within 1 month. To increase solubility, heat the tube to 37°C and then oscillate in an ultrasonic bath for some time. |
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| Shipping Condition | Evaluation sample solution: shipped with blue ice. All other sizes available: with RT, or with Blue Ice upon request. | ||
| Prepare stock solution | |||
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1 mg | 5 mg | 10 mg |
| 1 mM | 1.8526 mL | 9.263 mL | 18.5261 mL |
| 5 mM | 370.5 μL | 1.8526 mL | 3.7052 mL |
| 10 mM | 185.3 μL | 926.3 μL | 1.8526 mL |
Step 1: Enter information below (Recommended: An additional animal making an allowance for loss during the experiment)
g
μL
Step 2: Enter the in vivo formulation (This is only the calculator, not formulation. Please contact us first if there is no in vivo formulation at the solubility Section.)
Calculation results:
Working concentration: mg/ml;
Method for preparing DMSO master liquid: mg drug pre-dissolved in μL DMSO ( Master liquid concentration mg/mL, Please contact us first if the concentration exceeds the DMSO solubility of the batch of drug. )
Method for preparing in vivo formulation: Take μL DMSO master liquid, next addμL PEG300, mix and clarify, next addμL Tween 80, mix and clarify, next add μL saline, mix and clarify.
Method for preparing in vivo formulation: Take μL DMSO master liquid, next add μL Corn oil, mix and clarify.
Note: 1. Please make sure the liquid is clear before adding the next solvent.
2. Be sure to add the solvent(s) in order. You must ensure that the solution obtained, in the previous addition, is a clear solution before proceeding to add the next solvent. Physical methods such as vortex, ultrasound or hot water bath can be used to aid dissolving.
3. All of the above co-solvents are available for purchase on the GlpBio website.
Quality Control & SDS
- View current batch:
- Purity: >98.00% Appearance: A solid
- COA (Certificate of Analysis)
- SDS (Safety Data Sheet)
- Datasheet
Average Rating: 5 (Based on Reviews and 30 reference(s) in Google Scholar.)