Biotin-HPDP

Biotin-HPDPによるスルフィド化の評価

このプロトコールはガイドラインのみを提供し、ご自分の特定のニーズに合わせてご調整願います。

1.細胞の染色用の原液と希釈溶液の調製

（1）Sulfo-NHS-SS-Biotinの粉末をDMSOに溶解することでBiotin-HPDP原液（50mM）を調製する。

（2）DMSOを使い、Biotin-HPDP原液を0.8mMの最終濃度に希釈する。注：作業溶液は、実験当日に新鮮に調製しなければならない。

2.細胞の調製

実験の規模に応じて、培養細胞を6ウェルのプレートまたは60mmの培養皿に播種する。細胞が剥離しやすい場合は、poly-l/d-lysineでプレートまたは皿をプレコーティングして細胞の接着を増強する。

3.細胞表面におけるビオチンの標識

（1）プレートを氷の上で10分間インキュベートする。このステップは、更なる輸送またはエンドサイトーシスを止め、細胞膜にあるタンパク質のみがビオチンで標識されることを確保する。

（2）細胞を氷冷PBSで洗浄する。

（3）0.8mMのBiotin-HPDPをプレートに添加し、4℃、暗所で30分間、ゆっくり攪拌しながら30分間インキュベートする。

（4）細胞をPBSで二回洗浄し、その後、4℃、1%のウシ血清アルブミンを含有するPBSで10分間インキュベートし、未結合のビオチンすべてをクエンチする。PBSの中の50mMのグリシン溶液も、反応のクエンチに使える。

（5）回収の前に、細胞をPBSで二回洗浄し、残存のクエンチ緩衝液を除去する。

（6）150mM NaCl、50mM Tris-HCl（pH 7.4）、1mM EDTA、1% Triton X-100とプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する溶解緩衝液で、細胞を1.5mlのチューブに採取する。通常、1つの6ウェルプレートのサンプルにあたり200-300μlの溶解緩衝液を使う。細胞膜を破壊し、サンプルを均質化するためには、細胞を短い間、超音波処理する。上清を新しい1.5mlのチューブに移す。

4.ストレプトアビジン-ビオチンのインキュベーション

（1）50μlの50% ストレプトアビジンレジンを1.5mlのチューブに添加する。ビーズ懸濁液を反転させ、またはボルテックスミキサーで処理することで、ストレプトアビジンのビーズをゆっくり再懸濁する。ビーズが使用前に完全に混合されることを確保するべきである。

（2）4℃、エンドオーバーエンドローテーターで、1mlの溶解緩衝液を使い、ビーズを1時間インキュベートすることで平衡化する。チューブを卓上遠心機で短い間遠心分離し、上清溶液を吸引除去する。平衡化洗浄をもう一度繰り返す。最後の洗浄後、ゲルローディングチップを使い、残りの溶解緩衝液全てを注意深く、完全に除去する。

（3）細胞溶解液をビーズに添加する。その後、適量の溶解緩衝液を添加し、総体積を200μl/サンプルにする。

（4）4℃、エンドオーバーエンドのローテーターで、溶解液とストレプトアビジンの混合液を4時間から一晩インキュベートする。

（5）卓上遠心機を使い、上清溶液を吸引除去する。1mlの溶解緩衝液を添加し、4℃、エンドオーバーエンドのローテーターで5分間洗浄する。洗浄を更に二回繰り返す。最後の洗浄後、ゲルローディングチップを使い、残りの溶解緩衝液全てを注意深く、完全に除去する。

5.溶出、可視化と定量化

（1）225mMのTris-HCl（pH 8.45）、6%のグリセロール、2%のドデシル硫酸ナトリウムと65mMのジチオトレイトールを含有するサンプル緩衝液でビオチン化タンパク質を溶出する。37℃で60分間インキュベートする。

（2）溶出されたサンプルをSDS-PAGEで分離し、免疫ブロット法を行う。

6.実験の注意事項

（1）Biotin-HPDPが加水分解にやすいため、使用の直前に、Biotin-HPDPをDMSOに溶解し、ビオチン溶液が光から十分に保護されていることを確保する。

（2）このプロトコールと試薬は全て、科学研究のみに使うべきである。