MPEG-2000-DSPE (Synonyms: 1,2-DSPE-MPEG(5000), Methyl-PEG2000-DSPE, MPEG-2000-DSPE)

このプログラムはあくまで目安であり、それぞれのニーズに応じて変更してください。

タリン（親水性球状タンパク質として特徴づけられる植物レクチン）リポソームナノカプセル

1.分析天秤を使ってリポソームの成分を計量する。

2.材料の損失を避けるため、ロータリーエバポレーターに収める250 mL容フラスコを用い、脂質成分をクロロホルムに溶解する。

3.混合物を150 rpmで15分間攪拌する。

4.ロータリーエバポレーターを用い、以下の条件でクロロホルムを取り出す：

1. 加熱装置の水と接触させながら、最も効率がよくなるように、メスフラスコの口を標準の位置（25°）に合わせる。

注意：蒸発の効率に影響を与えず、また試料を傷つけないように、装置のアームは25°傾けて、メスフラスコとウォーターバスの接触を維持する必要がある。標準の位置は装置のブランドによって異なる場合がある。

1. コンデンサの温度を最低3 °Cに設定する。。
2. 加熱装置の温度を40±1 °Cに設定する。
3. 回転数を120 rpmにする。
4. 真空度を207 mbarに沸点を20 °Cに調整する。
5. 約25分間後、フラスコを取り出し、コンデンサーに残った蒸発溶剤を適当に捨てる。

注意：この工程ではリポソームの成分からなる薄い不透明な膜が形成され、容易に可視化できる。コンデンサーに残った蒸発溶剤は、廃棄用（塩素処理されたもの）に保存し、専門業者に適切処理されること。

5.1 mg/mLのタリンを含む0.3 Mの硫酸アンモニウム溶液（pH = 7.4）中で、脂質の濃度が0.01 Mになるように脂質フイルムを溶解し、最終容量を10 mLとする。

1.混合物を40分間で攪拌し、4 °Cで一晩インキュベートする。

注意：このステップは停止点とみなすことができる。一晩のインキュベーションはそんなに必要ではない。

6. インキュベーションの後、懸濁液を25 °C（室温；RT）で1分間超音波処理し、ベシクルのサイズを小さくしてアグリゲーションを避ける。

注意：超音波ソニケーターで以下の条件で粒径減少を行った：130 W、40 kHz。

7.0.2 µmのポリカーボネートの細孔膜を通して12サイクルの押し出しを行う。

注意：押出の工程の前に、サンプル漏れを防ぐため、ミニ押出機アセンブリを水でテストしてください。孔径0.1 µmのメンブレンも適している。この場合、ミニエクストルーダーホルダーを脂質転移温度以上に予熱し、脂質とタンパク質の物理化学的特性を維持しながら、押し出しを容易にする。 

1.メーカーのマニュアルに従って、ミニ押出機の部品を取り付ける。

2.ポリカーボネートの膜を、あらかじめ濡らしておいた2枚のフィルター支持体の間に挟み、ホルダーにセットする。

3.1 mLの空のシリンジを装置に差し込み、もう一方のシリンジにリポソーム懸濁液を全容量で注入し、反対側に差し込む。

4.0.2 µmのポリカーボネートの細孔膜を通して12サイクルの押し出しを行う。サンプルをシリンジから別のシリンジにゆっくりと押し出す。押し出された懸濁液をあらかじめ冷却したチューブに集める。

　　　注意：ポリカーボネートの膜は、シリンジからほかのシリンジへのサンプルの移動が難しくなった場合のみ交換する。リポソームの懸濁液は、押し出しの間に小さな1枚膜小胞（SUV）が形成され、サイズが小さくなるため、透明になるはずである。この工程で約0.2 mLの試料が失われることがある。

8.超遠心分離によりリポソームを分離する。通过超速离心分离脂质体。

注意：超遠心機の準備が整うまで、サンプルは氷水に浸しておく。スイングバケットローターを備えた超遠心機を用いて超遠心分離を行い、SUVと残りの成分および硫酸アンモニウムを分離する（下記の通り詳しく参照）。

1.ローターに適合するチタン製チューブに試料を計量し、チューブのバランスをとる。チューブを傷つけないように、用いるローターに応じた最低の必要量を確認し、必要であれば硫酸アンモニウムでリポソームの懸濁液の量を調整する。

　　　注意：スイングバケットは遠心分離機が回転速度を決定するために使う「ゼブラストライプ」（すなわち、底面の黒いと白いのストライプ）に傷をつけないように、遠心分離機の外ではつねにスタンドで支える必要がある。

2.遠心分離機を使うまえに、真空をオンにし、冷蔵庫で冷やす。

3.チタンチューブをスイングバケットにはめ込む。

　　　注意：チューブを走行時の位置まで持ち上げ、ぴったりと装着されていることを確認してください。

4.真空を解除し、遠心分離機のドアを開け、ローターを中に入れる。

　　　注意：ローターの底にある丸マークに注意してください。ローターは、遠心分離機の自体に同じ丸マークと反対方向に適合する必要がある。

5.遠心分離機のドアを閉め、真空を押し、真空度が200μmから20μm未満になるまで、または26 Paから3 Pa未満になるまで待つ。

6.超遠心機ディスプレイのパラメターを150,000 x g（前述のスイングバケットの29,600 rpmに相当する）に調整し、4 °Cで90分間（加速度：最大、減速度：最大）。

注意：もし特定の遠心分離機がrpmで設定されている場合は、かならず速度をx gに変換してください。

7.Recallを押し、条件を確認し、Startを押して実行する。

　　　注意：遠心分離機が希望の速度に達するまで待つ。

8.90分の後、バキュームボタンを押して真空を解除し、真空度が200-700 μm（26-93 Pa相当）になったら遠心分離機のドアを開ける。

9.遠心分離機のスイッチを切り、内部からローターを取り出し、バケツとともにベンチに置いて乾かす。

10.超遠心分離したサンプルを氷上に維持する。

9.チューブを逆さにして使い捨ての15 mLの遠心チューブに入れ、上清とペレットを慎重に分ける。

注意：未カプセル化タンパク質を含む上清は4°Cで保存する。カプセル化の効率を測定するために用いる。ペレットは半透明のゼリー状になる。

10.カプセル化タンパク質を含むペレットをHEPES緩衝生理食塩水（3 mL 1x HBS）に懸濁する。

注意：HBS 2x（原液）は、以下の量の試料を蒸留水で希釈して調製する：140 mM NaCl、1.5 mM Na₂HPO₄、50 mM HEPES、pH値を7.4に調整し、最終容量を100 mLにする。もしリポソームの濃度を測定する場合は、障害を避けるために、Na₂HPO₄をNaHCO₃に置き換えるか、または省略することができる。HBS 2x原液は、使用前に蒸留水で希釈しHBS 1xとする。

References:

[1] Papachristos A, Pippa N, Ioannidis K, Sivolapenko G, Demetzos C. Liposomal forms of anticancer agents beyond anthracyclines: present and future perspectives. Journal of liposome research. 2015 Apr 3;25(2):166-73.