H2DCFDA (DCFH-DA)

이 계획은 단지 가이드를 제공하고 구체적인 필요에 따라 수정하시기 바랍니다.

1.염색 용액 준비

(1) 저장 용액 준비: H2DCFDA(DCFH-DA)를 DMSO에 녹이고 1-10mM 농도의 저장 용액을 준비합니다.

참고: 사용하지 않은 저장 용액은 반복적인 냉동 및 해동을 피하기 위해 어둠에서 -20°C나 -80°C에서 조각하여 보관해야 합니다.

(2) 작업 용액 준비: 적당한 버퍼(무혈청 매체나 PBS 등)로 저장 용액을 희석하여 1-10μM 농도의 작업 용액을 준비합니다.

참고: 실제 상황에 따라 작업 용액의 농도를 조정하고 지금 준비하십시오.

2.세포 서스펜션 염색

(1) 현수전지: 4°C에서 1000g로 3-5분간 촘심하여 상청을 버리고 PBS로 5분마다 두 번 헹깁니다.

(2) 고착세포: PBS로 두 번 헹깁니다, 첨가한 트립신으로 세포를 분해시키고 분해가 완료된 후 1000g로 3-5분간 촘심합니다.

(3)H2DCFDA(DCFH-DA) 작업 용액을 추가하여 세포를 소생시키고 37°C의 어두운 곳에서 5-30분간 배양합니다. 다양한 세포에 대한 최적 배양 시간은 달라서 구체적인 실험 요구에 따라 스스로 탐색하시기 바랍니다.

(4)배양 후 1000g로 5분간 촘심하여 상청을 제거하고 PBS를 추가하여 5분마다 2-3번 세척합니다.

(5)미리 예열한 무혈청 세포 배양 액이나 PBS와 세포를 함께 배양합니다.

3.세포 접착 염색

(1) 멸균된 코버슬립에 벽에 고착세포를 재배양합니다.

(2) 배양액에서 코버슬립를 제거하고 과잉 배양액을 빨아들여 습한 환경에 놓습니다.

(3) 코버슬립의 한 모서리에서 100 μL의 염료 작업 용액을 추가하고 살짝 흔들어 모든 세포를 염료로 균일하게 덮습니다.

(4) 37°C의 어두운 곳에서 5-30분간 배양합니다. 다양한 세포에 대한 최적 배양 시간은 달아서 구체적인 실험 요구에 따라 스스로 탐색하시기 바랍니다.

(5) 배양 후 염료 작업 용액을 버리고 미리 데웠던 배양액으로 코버슬립를 2~3번 세척합니다.

(6) 미리 예열한 무혈청 세포 배양 기재나 PBS와 세포를 함께 배양합니다.

4.현미경 탐지: H2DCFDA(DCFH-DA)의 최대 자외선/발광 파장은 488/525nm입니다.

주의사항:

① 디에세트산 유래물에 대해서는 세포 내 에스테르가 이들을 수화하여 염료가 산화응답에 반응할 수 있도록 짧은 복구 시간이 필요합니다. 최적의 복구 시간 범위가 넓은 이유는 특정 세포 유형이 종종 매우 낮은 수준의 에스테르 활동을 보이기 때문입니다;

② 세포를 실험적 자극에 노출하기 전에 세포의 배경 형광 강도를 측정해야 합니다;

③ 흐름세포기 분석에 있어 세포가 염료 처리 전후의 전방각 산란과 측방각 산란이 변하지 않아야 하며 세포 크기의 변화는 약물 처리나 독성 반응에 의해 발생할 수 있습니다;

④ 세포를 포함하지 않는 실험 시스템에서 형광 강도 탐지를 수행하는 것이 좋습니다. 세포 외 에스테르및 기타 산소아제가 없는 상황에서 시간이 지남에 따라 점진적으로 증가하는 형광 강도는 순간 수화, 공기 산화, 빛으로 인한 산화 등 요인과 관련이 있을 수 있습니다;

⑤ 통제군(의약품 미투여) 세포에 대해서는 세포 내의 효소나 자연 항산화물질이 산소 자유기들을 제거합니다. 염료 부하 복구 시간 후 건강한 세포는 낮은 수준의 형광 강도 신호를 보이고 전체 실험 기간 동안 상대적으로 안정되어야 합니다;

⑥ 형광 강도 신호의 점진적 증가(자기산화로 인해)나 감소(세포 내 염료 손실이나 형광억제로 인해)가 관찰될 수 있습니다;

⑦ 자극물이나 유도제를 포함하지 않는 시스템에서 건강하고 처리되지 않은 세포에서 갑자기 강한 형광 강도를 발견하면 세포 사망이나 다른 산화 이벤트가 나타난다는 것을 의미합니다;

⑧ 형광 염료 모두 차폐 박스 문제들을 가지고 있습니다. 형광억제를 늦추기 위해 빛을 피해하시기 바랍니다.

⑨ 안전과 건강을 위해 실험복과 일회용 장갑을 착용해 주십시오.