Sel-green

살아있는 세포에서 Sel-green 프로브를 이용한 셀레놀 형광 이미징 적용[1]

본 프로토콜은 연구 데이터에서 개조되었고 참고용으로만 제공됩니다. 특정 실험 요구사항에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.

1.시약 준비: Sel-green을 디메틸술폰 (DMSO)에 용해하고 적절한 농도 (예: 5-10mM)의 주식 용액을 제조합니다. 사용 전에 세포 배양 배지로 희석해서 작업 농도 20µM으로 만듭니다. 세포 배양 배지를 사용해서 셀레늄 화합물(예: Na₂SeO₃, (Sec)₂ 등)을 포함한 처리 용액을 제조합니다. 작업 농도는 일반적으로 5µM입니다. 완전 배양지는 10% 태아 소 혈청(FBS), 2mM 글루타민, 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신을 포함합니다.

2. 세포 배양 및 접종: 상기 완전 배양지에서 37°C, 5% CO₂ 조건 하에 세포(예: HepG2, HeLa)를 일상적으로 배양합니다. 이미징 실험 하루 전에 세포를 적절한 밀도로 12웰 또는 24웰 판에 접종하고 적절한 양의 배양지를 첨가합니다(예: 12웰 판당 1mL, 24웰 판당 0.5mL). 세포가 부착되도록 24시간 배양합니다.

3.세포 처리 및 프로브 배양:

(1) 내인성 셀레놀의 유도: 내인성 셀레노시스테인(Sec)을 검출하기 위해 이미징 전 Na₂SeO₃(5µM)로 세포를 1시간 또는 12시간 전처리해서 세포내 Sec 수치를 증가시킵니다.

(2) 외인성 셀레놀의 검출: 외인성 Sec를 검출하기 위해 세포를 (Sec)₂(5µM)로 1시간 처리합니다.

(3) 다양한 셀레늄 화합물의 대사 연구: 표적 셀레늄 화합물(예: SeO₂, Na₂SeO₃, DBDS 등; 5µM)로 세포를 1, 6 또는 12시간 처리합니다. 처리 후에 미리 예열한 PBS로 세포를 세 번 세척하고 배양지에 잔류한 화합물을 제거합니다.

4.형광 이미징: 세척된 세포에 신선하게 제조한 Sel-green 작업 용액(배양지 중 20µM)을 첨가합니다. 37°C에서 어둠 속에서 30분간 배양합니다. 배양 후 PBS로 세포를 세 번 세척해서 결합되지 않은 프로브를 제거합니다. 즉시 형광 이미징 시스템을 사용해서 관찰하고 이미지를 촬영합니다. Sel-green은 여기/방출 파장이 약 370/502nm인 녹색 형광을 발생시킵니다.

주의 사항:

(1) Sel-green은 생리학적 조건(pH=7.4)에서 작동하는 최초의 선택적 셀레놀 프로브입니다. Sec에 대한 반응 신호는 일반적인 생물학적 티올(예: Cys, GSH)에 대한 것보다 100배 이상 높습니다.

(2) Sel-green의 잠재적 단점은 세포 이미징에서 상대적으로 낮은 감도를 가진다는 것이고 생체 내 저농도 내인성 셀레놀 검출에의 적용을 제한할 수 있습니다.

(3) 안전과 건강을 위해 작업 중 실험복과 일회용 장갑을 착용하시기 바랍니다.

References:
[1] Zhang B, Ge C, Yao J, et al. Selective selenol fluorescent probes: design, synthesis, structural determinants, and biological applications. J Am Chem Soc. 2015 Jan 21;137(2):757-69.